+ آنالیز و روشهای دستگاهی

روشهای آنالیز دستگاهی

1.    اسپکتروفتومتر ناحیه مریی Spectrophotometer
2.    اسپکتروفتومتر ماورابنفش Spectrophotometer
3.    پلاریمتری Polarimetry
4.    تعیین ضریب شکست مواد با رفرکتومترRefractometer         
5.    سپکتروفلوریمتریSpectroflourimetry
6.    اسپکتروفتومتری جذب اتمی Atomic Absorption
7.    گاز کروماتوگرافی  GC 
8.    کروماتوگرافی مایع با فشار زیادHPLC
9.    گاز کروماتوگرافی جرمی   GC-Mass
10.    اسپکتروفتومتری تشدید مغناطیسی هسته NMR       
11.    اسپکتروسکوپی مادون قرمزInfra red(IR)

 

اسپکتروفتومتر ناحیه مریی Spectrophotometer

روشهای طیف سنجی براساس بر هم کنش تابش الکترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون امواج الکترومغناطیس، حاصل کاهش سرعت ذرات با بار الکتریکی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب افزایش سرعت ذرات می گردد. علاوه بر این انرژی نورانی در بر هم کنش با ماده و جذب آن توسط ماده، باعث برانگیختن ماده به ترازهای انرژی بالاتر می گردد. بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده بر هم کنش کرده و پدیده خاصی را سبب می گردد که اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپکتروفتومتری را تشکیل می دهد.و می تواند شامل کلیه نواحی طیف الکترومغناطیس از اشعه گاما و ناحیه مریی تا امواج رادیویی باشد. در این رابطه، روشهای جذب، نشر، شکست، پراش (Diffraction) و پلاریزه شدن نور را می توان مورد توجه قرار داد که مهمترین آنها روشهای اسپکتروفتومتری جذبی و نشری و فلورسانس است.

طول موج نور مریی بیشتر و در نتیجه انرژی آن کمتر از UV است. در اثر تابش نور به ماده در آن نقل و انتقالات الکترونی صورت می گیرد، e ها تحریک شده و به سطوح انرژی بالاتر می روند. بسته به ساختمان شیمیایی جسم، نقل و انتقالات الکترونی مختلفی می تواند صورت گیرد، و محل جذب بستگی به ساختمان شیمیایی ماده دارد. بنابراین از g_maxبرای شناسایی مواد استفاده می شود که طول موجی است که در آن حداکثر جذب صورت می گیرد و برای تعیین غلظت جسم مجهول g_max را به نمونه می تابانیم. مقدار جذب از قوانین جذب Bear & Lambert پیروی می کند و از رابطه A=e lc محاسبه می شود.

معمولا در محدوده ای که جذب با غلظت رابطه خطی دارد ،تعیین مقدار انجام می شود.اگر غلظت نمونه و استاندارد به هم نزدیک باشد و غلظتها هم در محدوده خطی باشند، می توان با استفاده از تناسب  محاسبات را انجام داد.

 

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروسکوپ

اسپکتروفتومتر از دو بخش اسپکترومتر و فتومتر تشکیل شده است. اسپکترومتر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع نور، عدسی، شکافها، منوکروماتور (صافی، منشور یا ((Grating system) می باشد. بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور می باشد.

1- منبع نورانی:منبع نور مورد استفاده در اسپکتروفتومتر بسته به ناحیه مورد استفاده، متفاوت می باشد. برای نورهای مرئی از لامپ تنگستن استفاده می شود که نورهایی با طول موج بین 350 تا 800 نانومتر ایجاد می کند. و برای نورهای ماوراء بنفش (UV) از لامپ جیوه، هیدروژن استفاده می شود. این لامپها در ناحیه بین 200 تا 600 نانومتر بکار می روند. در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع لامپ وجود دارد.

2- عدسی ها: (آینه ها): برای کنترل کردن مسیر نور، وجود عدسی لازم است. به جای عدسی ها از آینه هایی که به شکل نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود.

3- شکافها (slits): در هر اسپکتروفتومتری دو شکاف وجود دارد: یکی را شکاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند. شکافها رل مهمی در جداکردن نور دلخواه با طول موج مشخص دارند. به همین جهت اندازه این شکافها بسیار مهم هستند. بیشتر دستگاهها پیچی دارند که اندازه این شکافها را می توان برحسب احتیاج تغییر داد. هر چه طول این شکافها بیشتر باشد پهنای نور عبوری (band-pass) بیشتر بوده و دامنه طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری که مورد نیاز نیستند عبور می کنند. این نور اضافی را Stray light می نامند

4- منوکروماتور(monochromators): اشعه نورانی پس از عبور از عدسی ها و شکاف مقدار و مسیر آنها کنترل شده سپس به دستگاهی که می تواند نور پلی کروم را به منوکروم تبدیل کند وارد می شود. پس نوری با طول موج مشخص و انتخابی به وجود می آورند. دو نوع منوکروماتور وجود دارد منشور و Grating.

5- محل نمونه:ظرف محتوی نمونه را سل یا کووت (cuvett) می نامند که از جنس شیشه، کوارتز یا پلاستیک است. برای اندازه گیری شدت رنگ محلولها و بلانک بکار می رود. سلهای شیشه ای و پلاستیکی برای ناحیه مرئی به کار می رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل کوارتز استفاده می شود. طول سلها معمولا 1 سانتی متر است و سلهایی با طول cm 1/0 تا cm 10 نیز موجود می باشد. محل قرار گرفتن نمونه بسته به اینکه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بلانک) دارد یا نه، Single beam و Double beam نام دارد. و کووت ها برحسب نوع شیشه و شکل چند نوع می باشند.

1- کووتهای مکعبی: سطح مقطع این کووت ها مربع بوده و از جنس شیشه خالص (برای نورهای مرئی) و کوارتز( برای نور ماوراء بنفش) می باشند. شیشه نور مرئی را از خود عبور می دهد ولی نور ماوراء بنفش را به مقدار زیادی جذب می کند. کووتهای مکعب، گران و کارکردن و تمیز نگهداشتن آنها دقت بسیار لازم دارد.

2- کووتهای گرد: سطح مقطع این دسته از کووتها گرد بوده و برای کارهای روزمره آزمایشگاهی بکار می روند. با همه دقتی که در ساختن کووتها می شود ،مکرر دیده می شود که آیا A دو کووت مشابه، یکسان نیست. برای جلوگیری از استفاده کووتهای ناجور باید آنها را کالیبره نمود.

برای کالیبره کردن کووتها محلولی را که نسبتا پایدار است مثل هموگلوبین با غلظت 50 میلی گرم درصد میلی لیتر تهیه می نمایند. باید T این محلول در طول موج nm 540 برابر 3/0 ± 50% باشد. راه دیگراینست که به جای کالیبره کردن کووتها از یک کووت برای شاهد و استانداردو نمونه استفاده کنند.

نکات زیر را باید درباره کووت ها رعایت کرد:

1- هرگز قسمت پایین کووت را با دست نمی گیرند چون نور از این قسمت کووت عبور می کند.

2- کووت را دو بار با محلول مورد آزمایش آبکشی می نمایند.

3- موقع استفاده از کووت ها آنها را با پارچه نرمی که پرز ندهد پاک می کنند در صورت امکان از کاغذهای مخصوص پاک کردن عدسی استفاده می نمایند.

4- محلول داخل کووت باید عاری از حباب هوا باشد.

5- کووت را طوری در اسپکتروفتومتر قرار می دهند که علامت مخصوص روی کووت به طرف خواننده باشد.

6- معمولا از همان مسیری که کووت را در اسپکتروفتومتر قرار داده اند از همان مسیر هم آن را خارج می کنند.

7- وقتی از دستگاه استفاده نمی شود دریچه روی محفظه کووت را می بندند.

8- کووتها را با محلول تمیز کننده قوی نمی شویند. حتی در محلولهای ضعیف نیز به مدت طولانی قرار نمی دهند.

9- در صورت اجبار داخل کووت را با سوآپ پنبه ای تمیز می کنند.

10- از کووتهای کالیبره نشده استفاده نمی کنند.

11- باید اندازه کووت و حجم محلول اندازه گیری مناسب باشد..

6- دتکتور (نور سنج): نور پس از عبور از عدسیها و شکافها و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می رود. اسباب منوکروماتور، نور دلخواه و با طول موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند. رنگ این نور مکمل رنگ محلول است. اگر رنگ محلول سبز- آبی (مثل تعیین مقدار گلوکز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج nm  495-475 باشد رنگ فیلتر- منشور یا گریتینگ باید نارنجی یا نزدیک آن با طول موج بین nm 620-600 باشد. چون رنگهای نارنجی مکملش سبز-آبی است. بنابراین وقتی منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی که در لوله وجود داشته و بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد ،جذب شده و بقیه آن به نورسنج می رسد. نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الکتریکی قادر است که مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد ترانس – میتانس آن اندازه گیری نماید. دتکتورها شامل انواع فتوشیمیائی، فتوالکتریکی و حرارتی می باشد که در ناحیه مرئی و ماوراء بنفش از دتکتورهای فتوالکتریکی مانند فتوولتتیک و فتوتیوب و فتومولتی پلایر تیوب استفاده می شود.

7- رکوردر (الکتریک سنج)در اسپکتروفتومتر احتیاج به دستگاهی است که جریان الکتریکی دتکتور را اندازه بگیرد. دو سیستم گالوانومتر و نول پوینت وجود دارد که در اسپکتروفتومترهایی که دارای نواحی مرئی باشند معمولا از یک گالوانومتر یا صفحه دیجیتالی استفاده می شود. دیاگرام زیر، طرح یک اسپکتروفتومتر ساده را نشان می دهد.

 

 

 

 

        گالوانومتر            دتکتور        نمونه         عدسی    شکاف    منوکروماتور   شکاف         عدسی         منبع نور    

 

طرز کار:

1- پس از اتصال به برق مدتی باید صبر کرد تا دستگاه گرم شود

2- طول موج ماکزیمم را روی دستگاه تنظیم می نمایند.

3- در شرایطی که جا سلی دستگاه، خالی است با در باز یا بسته (بستگی به نوع دستگاه دارد) صفر ترانس میتانس را تنظیم می کنیم.

4- بلانک آبی و بلانکهای دیگر را در جا لوله ای دستگاه گذاشته آن را روی صددرصد T و یا صفر A تنظیم می کنند.

5- نمونه ها را در سل ریخته و مقدار جذب آنها را می خوانیم.

6- سلها حتما باید تمیز بوده و قطرات محلول اطراف آن باید با دستمال کاغذی پاک شود.

 

کار عملی جلسه اول: اسپکتروفتومتری در ناحیه مرئی (vis)

هدف: اندازه گیری غلظت بی کرومات (k₂cr₂o7) در یک محلول مجهول

روش کار:

ابتدا استوک (stock) بی کرومات پتاسیم را تهیه می کنیم. مقدار موردنیاز جهت تهیه محلول ppm 1000 از یون کروم را محاسبه کرده پس از وزن کردن در بالن ژوژه 1000 می ریزیم، cc 15 اسید سولفوریک غلیظ به آن اضافه کرده با آب مقطر به حجم می رسانیم. از این محلول، محلولهایی با غلظت های (cc 100 /mg 9، 7، 5، 3، 1) که همین حجم را باید به بالن 100 به حجم برسانید، تهیه کرده و مقدار جذب نمونه های مجهول را توسط دستگاه می خوانیم. در پایان نمودار جذب برحسب غلظت را رسم کرده، غلظت نمونه مجهول را بدست می آوریم.

سوال: برای تهیه محلول استوک ppm 1000 بی کرومات پتاسیم چه مقدار باید بی کرومات برداریم؟

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست

 

اسپکتروفتومتر ماورابنفش Spectrophotometer

روشهای طیف سنجی براساس بر هم کنش تابش الکترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون امواج الکترومغناطیس، حاصل کاهش سرعت ذرات با بار الکتریکی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب افزایش سرعت ذرات می گردد. علاوه بر این انرژی نورانی در بر هم کنش با ماده و جذب آن توسط ماده، باعث برانگیختن ماده به ترازهای انرژی بالاتر می گردد. بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده بر هم کنش کرده و پدیده خاصی را سبب می گردد که اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپکتروفتومتری را تشکیل می دهد.و می تواند شامل کلیه نواحی طیف الکترومغناطیس از اشعه گاما و ناحیه مریی تا امواج رادیویی باشد. در این رابطه، روشهای جذب، نشر، شکست، پراش (Diffraction) و پلاریزه شدن نور را می توان مورد توجه قرار داد که مهمترین آنها روشهای اسپکتروفتومتری جذبی و نشری و فلورسانس است.

طول موج نور مریی بیشتر و در نتیجه انرژی آن کمتر از UV است. در اثر تابش نور به ماده در آن نقل و انتقالات الکترونی صورت می گیرد، e ها تحریک شده و به سطوح انرژی بالاتر می روند. بسته به ساختمان شیمیایی جسم، نقل و انتقالات الکترونی مختلفی می تواند صورت گیرد، و محل جذب بستگی به ساختمان شیمیایی ماده دارد. بنابراین از g_maxبرای شناسایی مواد استفاده می شود که طول موجی است که در آن حداکثر جذب صورت می گیرد و برای تعیین غلظت جسم مجهول g_max را به نمونه می تابانیم. مقدار جذب از قوانین جذب Bear & Lambert پیروی می کند و از رابطه A=e lc محاسبه می شود.

معمولا در محدوده ای که جذب با غلظت رابطه خطی دارد ،تعیین مقدار انجام می شود.اگر غلظت نمونه و استاندارد به هم نزدیک باشد و غلظتها هم در محدوده خطی باشند، می توان با استفاده از تناسب  محاسبات را انجام داد.

 

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروسکوپ

اسپکتروفتومتر از دو بخش اسپکترومتر و فتومتر تشکیل شده است. اسپکترومتر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع نور، عدسی، شکافها، منوکروماتور (صافی، منشور یا ((Grating system) می باشد. بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور می باشد.

1- منبع نورانی:منبع نور مورد استفاده در اسپکتروفتومتر بسته به ناحیه مورد استفاده، متفاوت می باشد. برای نورهای مرئی از لامپ تنگستن استفاده می شود که نورهایی با طول موج بین 350 تا 800 نانومتر ایجاد می کند. و برای نورهای ماوراء بنفش (UV) از لامپ جیوه، هیدروژن استفاده می شود. این لامپها در ناحیه بین 200 تا 600 نانومتر بکار می روند. در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع لامپ وجود دارد.

2- عدسی ها: (آینه ها): برای کنترل کردن مسیر نور، وجود عدسی لازم است. به جای عدسی ها از آینه هایی که به شکل نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود.

3- شکافها (slits): در هر اسپکتروفتومتری دو شکاف وجود دارد: یکی را شکاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند. شکافها رل مهمی در جداکردن نور دلخواه با طول موج مشخص دارند. به همین جهت اندازه این شکافها بسیار مهم هستند. بیشتر دستگاهها پیچی دارند که اندازه این شکافها را می توان برحسب احتیاج تغییر داد. هر چه طول این شکافها بیشتر باشد پهنای نور عبوری (band-pass) بیشتر بوده و دامنه طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری که مورد نیاز نیستند عبور می کنند. این نور اضافی را Stray light می نامند

4- منوکروماتور(monochromators): اشعه نورانی پس از عبور از عدسی ها و شکاف مقدار و مسیر آنها کنترل شده سپس به دستگاهی که می تواند نور پلی کروم را به منوکروم تبدیل کند وارد می شود. پس نوری با طول موج مشخص و انتخابی به وجود می آورند. دو نوع منوکروماتور وجود دارد منشور و Grating.

5- محل نمونه:ظرف محتوی نمونه را سل یا کووت (cuvett) می نامند که از جنس شیشه، کوارتز یا پلاستیک است. برای اندازه گیری شدت رنگ محلولها و بلانک بکار می رود. سلهای شیشه ای و پلاستیکی برای ناحیه مرئی به کار می رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل کوارتز استفاده می شود. طول سلها معمولا 1 سانتی متر است و سلهایی با طول cm 1/0 تا cm 10 نیز موجود می باشد. محل قرار گرفتن نمونه بسته به اینکه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بلانک) دارد یا نه، Single beam و Double beam نام دارد. و کووت ها برحسب نوع شیشه و شکل چند نوع می باشند.

1- کووتهای مکعبی: سطح مقطع این کووت ها مربع بوده و از جنس شیشه خالص (برای نورهای مرئی) و کوارتز( برای نور ماوراء بنفش) می باشند. شیشه نور مرئی را از خود عبور می دهد ولی نور ماوراء بنفش را به مقدار زیادی جذب می کند. کووتهای مکعب، گران و کارکردن و تمیز نگهداشتن آنها دقت بسیار لازم دارد.

2- کووتهای گرد: سطح مقطع این دسته از کووتها گرد بوده و برای کارهای روزمره آزمایشگاهی بکار می روند. با همه دقتی که در ساختن کووتها می شود ،مکرر دیده می شود که آیا A دو کووت مشابه، یکسان نیست. برای جلوگیری از استفاده کووتهای ناجور باید آنها را کالیبره نمود.

برای کالیبره کردن کووتها محلولی را که نسبتا پایدار است مثل هموگلوبین با غلظت 50 میلی گرم درصد میلی لیتر تهیه می نمایند. باید T این محلول در طول موج nm 540 برابر 3/0 ± 50% باشد. راه دیگراینست که به جای کالیبره کردن کووتها از یک کووت برای شاهد و استانداردو نمونه استفاده کنند.

نکات زیر را باید درباره کووت ها رعایت کرد:

1- هرگز قسمت پایین کووت را با دست نمی گیرند چون نور از این قسمت کووت عبور می کند.

2- کووت را دو بار با محلول مورد آزمایش آبکشی می نمایند.

3- موقع استفاده از کووت ها آنها را با پارچه نرمی که پرز ندهد پاک می کنند در صورت امکان از کاغذهای مخصوص پاک کردن عدسی استفاده می نمایند.

4- محلول داخل کووت باید عاری از حباب هوا باشد.

5- کووت را طوری در اسپکتروفتومتر قرار می دهند که علامت مخصوص روی کووت به طرف خواننده باشد.

6- معمولا از همان مسیری که کووت را در اسپکتروفتومتر قرار داده اند از همان مسیر هم آن را خارج می کنند.

7- وقتی از دستگاه استفاده نمی شود دریچه روی محفظه کووت را می بندند.

8- کووتها را با محلول تمیز کننده قوی نمی شویند. حتی در محلولهای ضعیف نیز به مدت طولانی قرار نمی دهند.

9- در صورت اجبار داخل کووت را با سوآپ پنبه ای تمیز می کنند.

10- از کووتهای کالیبره نشده استفاده نمی کنند.

11- باید اندازه کووت و حجم محلول اندازه گیری مناسب باشد..

6- دتکتور (نور سنج): نور پس از عبور از عدسیها و شکافها و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می رود. اسباب منوکروماتور، نور دلخواه و با طول موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند. رنگ این نور مکمل رنگ محلول است. اگر رنگ محلول سبز- آبی (مثل تعیین مقدار گلوکز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج nm  495-475 باشد رنگ فیلتر- منشور یا گریتینگ باید نارنجی یا نزدیک آن با طول موج بین nm 620-600 باشد. چون رنگهای نارنجی مکملش سبز-آبی است. بنابراین وقتی منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی که در لوله وجود داشته و بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد ،جذب شده و بقیه آن به نورسنج می رسد. نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الکتریکی قادر است که مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد ترانس – میتانس آن اندازه گیری نماید. دتکتورها شامل انواع فتوشیمیائی، فتوالکتریکی و حرارتی می باشد که در ناحیه مرئی و ماوراء بنفش از دتکتورهای فتوالکتریکی مانند فتوولتتیک و فتوتیوب و فتومولتی پلایر تیوب استفاده می شود.

7- رکوردر (الکتریک سنج)در اسپکتروفتومتر احتیاج به دستگاهی است که جریان الکتریکی دتکتور را اندازه بگیرد. دو سیستم گالوانومتر و نول پوینت وجود دارد که در اسپکتروفتومترهایی که دارای نواحی مرئی باشند معمولا از یک گالوانومتر یا صفحه دیجیتالی استفاده می شود. دیاگرام زیر، طرح یک اسپکتروفتومتر ساده را نشان می دهد.

 

 

 

 

        گالوانومتر            دتکتور        نمونه         عدسی    شکاف    منوکروماتور   شکاف         عدسی         منبع نور    

 

طرز کار:

1- پس از اتصال به برق مدتی باید صبر کرد تا دستگاه گرم شود

2- طول موج ماکزیمم را روی دستگاه تنظیم می نمایند.

3- در شرایطی که جا سلی دستگاه، خالی است با در باز یا بسته (بستگی به نوع دستگاه دارد) صفر ترانس میتانس را تنظیم می کنیم.

4- بلانک آبی و بلانکهای دیگر را در جا لوله ای دستگاه گذاشته آن را روی صددرصد T و یا صفر A تنظیم می کنند.

5- نمونه ها را در سل ریخته و مقدار جذب آنها را می خوانیم.

6- سلها حتما باید تمیز بوده و قطرات محلول اطراف آن باید با دستمال کاغذی پاک شود.

 

کار عملی جلسه دوم: اسپکتروفتومتری در ناحیه ماوراء بنفش (UV)

هدف: تعیین مقدار قرص های آسپیرین 100 میلی گرمی

روش کار:

10 عدد قرص آسپیرین 100 میلی گرمی را وزن کرده در هاون ساییده، میانگین وزن 1 قرص را در اندکی آب مقطر حل می کنیم. اکسپیان آن که نشاسته است در آب حل نمی شود، پس آن را صاف کرده به بالن ژوژه ml 100 منتقل کرده با آب مقطر به حجم ml 100 می رسانیم. از این محلول ml 5/2 برداشته در بالن ژوژه ml 100 دیگری با ml 5 اسید کلریدریک مخلوط کرده با آب مقطر به حجم می رسانیم.

چرا Hcl؟ اگر اسید اضافه نکنیم، بدلیل حالت تعادل بین فرم یونیزه و غیریونیزه آسپیرین تعیین مقدار غیرممکن است. که با افزودن اسید تعادل به سمت فرم غیریونیزه می رود. g_max آسپیرین در محیط اسیدی و قلیایی متفاوت است.

25 میلی گرم پودر آسپیرین استاندارد را در بالن ژوژه ml 100 به حجم رسانده، ml 10 از آن برداشته با ml 5 اسید کلریدریک مخلوط کرده به حجم ml 100می رسانیم.

در مرحله بعد ،در دستگاه UV محلول استاندارد آسپیرین را scan کرده تا g_max آسپیرین را پیدا کنیم. آسپیرین دو جذب دارد یکی در حدود nm 230 و دیگری در حدود nm 300 .

جذب نمونه معلوم و مجهول آسپیرین را اندازه گیری کرده براساس آن درصد نمونه آسپیرین و غلظت نمونه مجهول را گزارش کنید (با کمک فرمول ).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست

پلاریمتری Polarimetry

این روش برای تجزیه کمی و کیفی اجسامی که فعالیت نوری دارند به کار می رود. نور سفید در تمام جهات ارتعاش دارد و اگر از اجسام Polaroid مانند بعضی مواد پلاستیکی یا بلورهای طبیعی مانند کلسیت که فرمول آنها CO₃Ca است عبور کند به دو اشعه تقسیم می شود. چون سرعت هر یک از دو اشعه در داخل بلور متفاوت است. در صورتی که بلور را در امتداد یکی از قطب ها با  یک زاویه مناسب برید. و مجددا آن را با صمغی بنام کانادا بالسام بچسبانیم، جزئی که اشعه عادی نامیده می شود منعکس شده و خارج می شود. در صورتی که جزئی که اشعه غیرعادی (پلاریزه) نامیده می شود بدون شکست خارج می شود ارتعاش این نور در یک سطح و عمود بر جهت انتشار آن است این بلور را که نور پلاریزه ایجاد می کند، منشور نیکل نامیده می شود. اجسامی دارای فعالیت نوری هستند که در ساختمان مولکولی آنها کربن ناقرینه (یعنی اتم کربنی که به چهار گروه مختلف متصل باشد) وجود داشته باشد. این اتم کربن باعث نامتقارن شدن مولکول می شود و مولکول نمی تواند بر تصویر آینه ای خود منطبق باشد. اگر این اجسام در مسیر نور پلاریزه قرار بگیرند باعث چرخش نور پلاریزه می شوند در صورتی که جسم نور پلاریزه را در جهت عقربه ساعت بچرخاند راست گردان (Dextrorotatory) می گویند و چنانچه در جهت عکس عقربه ساعت بچرخاند، آن را چپ گردان (Levorotatory) می گویند.

مقدار چرخش (a)با غلظت جسم (C)متناسب است. و یا می توان گفت نور پلاریزه وقتی از ترکیبات نامتقارن عبور کند، به علت پخش نامتقارن دانسیته الکترونی در مولکول، الکترونهای مولکول بطور نامتقارن بر نور پلاریزه اثر می گذارند و باعث چرخش آن حول محور انتشار می شوند. مولکولهائی که فعالیت نوری ندارند چون با پخش الکترونی متقارن مواجه هستند بر نور پلاریزه اثر ندارند.

ترکیباتی که تصویر آینه ای قابل انطباق نداشته باشند دارای ایزومر نوری هستند. دو ایزومر نوری یک زوج انانتیومر را تشکیل می دهند. که از نظر خواص فیزیکی و شیمیائی یکسان هستند و فقط در جهت چرخش نور پلاریزه اختلاف دارند. مخلوط مساوی دو انانتیومر که از نظر قدر مطلق یکسان ولی از نظر جهت مخالف هستند کاملا همدیگر را خنثی می کنند. چرخش حاصله صفر است به چنین مخلوطی راسمیک می گویند.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه پلاریمتر

1- منبع نور: تولید کننده نور تک رنگ است، چون میدان چرخش با  طول موج تغییر می کند. لذا باید به عنوان منبع از یک تولید کننده نور تک رنگ استفاده کرد. معمولا از لامپ بخار سدیم (خط زرد D) استفاده می شود. لامپ جیوه هم ممکنست بکار برده شود. طول موج لامپ سدیم 589.3 A° لامپ جیوه °546 A

2-شکاف( Slite) : میزان نور رسیده به نمونه را تنظیم می کند.

3- عدسی: موازی کننده نور

4- اولین منشور نیکل که پلاریزور نام دارد و نور را پلاریزه می کند.

5- سل نمونه: که استوانه ای شیشه ای است و جهت قرار دادن نمونه مورد آزمایش در داخل آن است طول آن dm 4، 3، 2، 1است. (حباب هوا اگر داشت در برآمدگی سل باید قرار گیرد.)

6- منشور نیکل دیگر که آنالایزور Analyzer بعنوان تجزیه کننده است که با چرخاندن آن

 می توان نور پلاریزه را به حالت اول برگرداند. و مقدار انحراف آن را بر حسب درجه از روی یک سطح دایره ای مدرج خواند.

در این حالت روشنائی دو نیم دایره ای که از عدسی چشمی ملاحظه می شود به یک اندازه خواهد بود.

7- عدسی چشمی و ردیاب (دتکتور): که معمولا از چشم انسان بعنوان ردیاب استفاده می شود.در دستگاههای پیشرفته فتوالکتریک هستند و تا 001/0 درجه را تعیین می کند.

1-4-پلاریمتر نیم سایه:

یک پلاریزور کوچک متحرک بنام نیکل نیم سایه بعد از پلاریزور قرار دارد که می توان آن را با چرخاندن طوری تنظیم نمود که مانع عبور نور شود. در این حالت نیمی از دایره ای که از عدسی چشمی ملاحظه می شود سیاه به نظر می رسد، بعد شدت نور هر دو نیم دایره را به وسیله چرخاندن آنالایزور مساوی تنظیم می کنیم. در این حالت دستگاه باید روی صفر باشد. با گذاشتن نمونه در مسیر نور، شدت روشنائی دو نیم دایره فرق می کند که بایستی با چرخاندن آنالیزور به حالت اول برگرداند و مقدار چرخش را که a نام دارد از روی درجات خواند.

 

 

 

 

 

چرخش ویژه (انحراف مخصوص) Specific rotation:

زاویه a به چند عامل بستگی دارد. که عبارتند از ماهیت ترکیب، غلظت یا دانسیته (برای مایعات) طول نمونه ای که باید نور از آن عبور کند (طول مسیر)، درجه حرارت، حلال، طول موج نور غلظت و طول مسیر اهمیت زیادی دارند چون تعداد متوسط مولکولهای فعال نوری تعیین

می شوند.

 

 

مقدار چرخش مخصوص برای یک جسم تحت شرایط معین ثابت است.

لذا از آن می توان بعنوان یک ثابت فیزیکی مثل نقطه ذوب و نقطه جوش و غیره استفاده کرد. رابطه انحراف مخصوص با ازدیاد درجه حرارت برای مقدار معینی از نمونه تغییر می کند. برای تجزیه کمی با دانستن انحراف مخصوص یک جسم خالصی  که در جداولی برای °C 20=t داده شده و اندازه گیری a با استفاده از فرمولهای فوق مقدار C( غلظت) را می توان حساب کرد.

یکی از مهمترین کاربردهای  پلاریمتری در صنایع قند است. وقتی محلولی فقط حاوی ساکارز باشد، پس از تعیین زاویه چرخش a بوسیله پلاریمتر می توان غلظت آن را تعیین کرد. صفر پلاریمتر را بایستی با آب مقطر تنظیم نمود یا مقداری که دستگاه برای آب مقطر نشان می دهد را یادداشت کرد. یا می توان منحنی استاندارد برای a برحسب C رسم کرد. منحنی ممکنست خطی، سهمی یا هذلولی باشد. چرخش مولکولی یک جسم در درجه حرارت T و طول موج l به

نمایش داده می شود. که با انحراف مخصوص وسیله رابطه زیر  مربوط می شود که M وزن مولکول جسم است.

 

 

 

 تغییرات چرخش مولکولی را طول موج نور پلاریزه ORD می گویند (Optical rotatory  dispersion)  که برای تشریح فرمول اجسامی که ساختمان پیچیده دارند به کار می رود.

کار عملی جلسه سوم پلاریمتری

هدف: شناسایی و تعیین غلظت مواد با استفاده از پلاریمتر

1- تهیه محلول استاندارد ساکارز به غلظت ml100 /g2 و مشاهده a برای تعیین a ویژه و چپگرد یا راستگرد بودن ساکارز و مشاهده a نمونه های مجهول ساکارز جهت تعیین غلظت آنها.

2- تعیین a و چپگرد یا راستگرد بودن ماده مجهول و تعیین اسم ماده طبق جدول و براساس محدوده a ویژه.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست

 

تعیین ضریب شکست مواد با رفرکتومترRefractometer         

هنگامی که یک شعاع نورانی از یک محیط به محیط دیگر با دانسیته متفاوت بطور مرتب عبور

 می کند، سرعت آن پس ازعبور از سطح تغییر خواهد کرد،این پدیده شکست((Refraction  نام دارد. اگر دانسیته نوری محیط دوم از محیط اول بیشتر باشد نور به خط عمود نزدیکتر می شود.

زاویه بین شعاع تابش و خط عمود، زاویه تابش (i) و زاویه بین شعاع شکست و خط عمود زاویه شکست (r) نامیده می شود.

 رفرکتومتری عبارتست از تعیین ضریب شکست بوسیله دستگاه رفرکتومتر،ضریب شکست یک ماده (n) عبارتست از نسبت سرعت عبور نور در خلا (c ) به سرعت عبور نور از آن ماده (v_i)

 

اما معمولا ضریب شکست مطلق اندازه گیری نمی شود. بلکه از ضریب شکست نسبی استفاده

 می شود:

که ضریب شکست با درجه حرارت (T) و طول موج (g)  تغییر می یابد. پس در اندازه گیری باید این دو پارامتر ثابت نگه داشته شوند.

در رفرکتومتر تنظیم به گونه ای است که نور از محیط رقیق غلیظ می شود. محیط رقیق، مایع یا محلول موردنظر ما و محیط غلیظ، منشور دستگاه است. در واقع،در عمل، ضریب شکست محلول و منشور نسبت به هم سنجیده می شود:

در رفرکتومتری زمانی ضریب شکست را اندازه می گیریم که زاویه تابش ° 90شود. در این حالت، زاویه شکست به حد زاویه شکست بحرانی می رسد (r به سرعت زاویه شکست بحرانی میل

 می کند):

r_C ® r Þ °90 = i  if

r_C N Sin  n= Þ 1 = Sin i  Þ

از ضریب شکست هم برای شناسایی و هم تعیین مقدار مواد محاسبه می شود.

برای کالیبراسیون و تعیین میزان خطای دستگاه از مواد در دسترس مانند آب مقطر (3325/1 = n) استفاده می کنیم. البته در کار ما، چون در همه نتایج یک خطای ثابت ایجاد می شود می توان آن را در نظر نگرفت. پرمصرف ترین رفرکتومتر، رفرکتومتر Abbe است و مزیت آن این است که با نور سفید معمولی کار می کند.

 

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه رفرکتومتر

1- دو منشور

- انتشار دهنده Diffusing prism

- شکست دهنده Refracting prism

جسم با بازکردن دو منشور، بین آنها قرار می گیرد. نور وارد منشور انتشار دهنده می شود و به یک g خاص تبدیل می شود (تجزیه می شود)، این نور با g مشخص وارد جسم شده و سپس وارد منشور Refracting  می شود. (ورود نور از محیط رقیق به غلیظ).

2- دو عدد لنز

- لنز تصویر

- لنز n (ضریب شکست)

در لنز تصویر، زمانی تصویر تنظیم خواهد بود که نیم دایره بالا روشن و نیم دایره پایین تیره باشد.

3- دو پیچ تنظیم: جهت تنظیم تصویر

پیچ بزرگتر (پایین) نیم دایره تیره را بالا و پایین می برد (این نیم دایره در تنظیم باید وسط باشد)

پیچ دیگر (بالا) خطوط رنگی بین دو نیم دایره را تنظیم می کند (باید در جایی بگذاریم که خطوط رنگی بین دو نیم دایره (قرمز و آبی) از بین برود یا حداقل خطوط رنگی را ببنیم.

4- ترمومتر: جهت گزارش دمای اندازه گیری

جهت ثابت نگه داشتن دما، می توان از جریان آب °C 20 استفاده کرد.

{جهت تنظیم لنز تصویر، (مشاهده تصویر) باید چراغ مطالعه در حالی که سرپایین است روشن باشد اما پس از تنظیم خاموش و سپس اعداد خوانده شود زیرا رشون بودن زیاد چراغ (به دلیل ایجاد حرارت) سبب تغییر ضریب شکست می شود.}

قبل از هر بار ریختن محلول، منشورها کاملا تمیز می شود با مقدار کمی از محلول موردنظر، شستشو داده می شد.

عدد صحیح ضریب شکست در میدان دید لنز تصویر مشاهده نمی شود وخودمان باید عدد صحیح یک را اضافه کنیم.

و اعداد خوانده شده همگی جزئ ارقام اعشاری خواهند بود که تا 4 رقم اعشاری گزارش

 می شود. اما چون فاصله هر دو خط نشانه 1/0 است، آخرین رقم اعشاری تقریبی تخمین زده می شود. مثلا خواندن عدد 37/34= ضریب شکست 3437/1

 

کار عملی جلسه چهارم رفرکتومتری

هدف: تعیین مقدار دکستروز در محلول با رفرکتومتری

ابتدا محلول های زیر شامل دکستروز را تهیه کردیم:

سپس به روش صفحه قبل با تنظیم مکان نیم دایره ها و محو خطوط رنگی تصویر بوسیله پیچ های تنظیم، در ابتدا ضریب شکست آب مقطر را می خواندیم:

 به همین ترتیب برای محلول های دکستروز و مجهول:

محاسبه میزان خطای دستگاه

از طریق رسم نمودار n در برابر C_M، C_M مجهولها را می یابیم:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست

 

 

 

 

اسپکتروفلوریمتریSpectroflourimetry

روشهای مختلفی که یک مولکول می تواند انرژی بدست آمده در اثر جذب را رها نماید بررسی می کنند. وقتی دفع انرژی به صورت انتشار امواج و در جهات مختلف صورت گیرد این پدیده را فتولومینانس می گویند که دو پدیده مهم در فتولومینانس، فسفرسانس و فلورسانس است. که این دو پدیده را از اندازه گیری مدت زمان حالت برانگیخته شد نشان می شناسند، که پدیده فسفرسانس بیشتر از فلورسانس می باشد. اما از نظر تجزیه فلورسانس مهمتر از فسفرسانس بوده و تایید بیشتری خواهد شد. به کمک اندازه گیری شدت فلورسانس غلظت های بسیار کم از اجسام آلی و معدنی را می توان اندازه گرفت. اگر زمان نشر نور بین^5-10 تا ^8-10 ثانیه، باشد فلورسانس و اگر از ^4-10 ثانیه بیشتر باشد فسفرسانس می گویند، حساسیت روش فلورسانس بیشتر از روش جذبی است و می توان غلظت های بسیار کم حدود ppm (چند قسمت در میلیون) یا 10/1 ppm را اندازه گرفت ولی کاربرد فلوریمتر کمتر از روشهای جذبی است چون اجسامی که قادر به تولید فلورسانس باشند کم هستند. از دو پدیده فلورسانس و فسفرسانس در تجربه کمی و کیفی استفاده می کنند. که استفاده فلورسانس در روش کمی بیشتر است. فلورسانس با غلظت های بسیار کم (مقادیر جزئی از غلظت رابطه خطی دارد). کاربرد دارد لذا می توانیم  برای تعیین غلظت استفاده کنیم. (FµC).

در فلورسانس وقتی منبع نور را خاموش می کنیم، نشر نور از جسم قطع می شود ولی در فسفرسانس بعد از خاموش کردن منبع هنوز هم جسم نور ساطع می کند  از نظر دقت روش، دقت فلورسانس خیلی بیشتر از UV است ولی کاربرد آن کمتر از اسپکتروسکوپی ماوراء بنفش است. زیرا تعداد داروهای دارای فلورسانس خیلی کم است. تنها بعضی داروها مثل بربرین (آلکالویید زرشک) مورفین و... فلورسانس دارند. در حالی که اکثر داروها جذب UV دارند. در بعضی مواقع می توان برای موادی که خود فلورسانس ندارند، از آنها مشتقی تهیه کرد و بعد فلورسانس آن مشتق را اندازه گیری کرد.       

 عمر لامپ در اینجا مهم است، هر چه لامپ مستهلک تر شود شدت فلورسانس کمتر می شود. در صورتی که در UV عمر لامپ زیاد مهم نیست.

 

که این نسبت بین 1-0 تغییر می کند.

هر چه شدت فلورسانس کمتر شود این نسبت به صفر نزدیکتر می شود. از نظر کیفی: می گوئیم در شرایط ثابت طول موج Ex و E_M هر جسم ثابت است. هر ماده یک طول موج تحریکی به نام Ex و یک طول موج نشری بنام E_M دارد. که در شرایط ثابت برای هر جسم مشخص است.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه فلوریمتری

1- منبع نور: لامپ مورد استفاده باید طول موجهای یکنواخت در ناحیهUV-Vis  ایجاد کند. که معمولا از لامپ گزنون استفاده می کنند که طول موجهای 600-200 نانومتر را ایجاد می کند. شدت فلورسانس بستگی به شدت نور تابیده شده دارد، پس هر چه لامپ مستهلک تر شود شدت فلورسانس کمتر می شود. برای این منظور از یک تایمر استفاده می کنند که عمر لامپ را نشان می دهد که با گذشت 500 ساعت از عمر لامپ آن را تعویض می کنیم.

2- منوکروماتور اولیه، است که نور تابیده شده از منبع را تک رنگ می کند. بعد از عبور از منوکروماتور اولیه جسم را در یک طول موج خاص تحریک می کند.

3- سل نمونه: از جنس کوارتز است و نباید ایجاد فلورسانس کند. چهار طرف سل شفاف است. و در محل تقاطع دو محور قرار دارد.

4- منوکروماتور ثانویه: که برای منوکروماتیک کردن نور فلورسانس است و عمود بر منوکروماتور اولیه است و طول موج E_M را از خود عبور می دهد (منوکروماتورها از نوع گریتینگ هستند) که طول موج بالاتر و از انرژی کمتری از E_X دارد.

5- دتکتور: که برای اندازه گیری شدت نور فلورسانس است و برای جلوگیری از تداخل، ردیاب را هم عمود بر مسیر نور اولیه قرار می دهند. ردیاب، یا دتکتور یا فتوسل معمولا از نوع فتومولتی پلایر است.

6- ثبات (رکوردر): گالوانومتر، یا شکل دیژیتال که آخرین قسمت دستگاه است. و جریان را ثبت می کند و طیف فلورسانس جسم را رسم می کند.

 

کار عملی جلسه پنجم فلوریمتری

هدف: تعیین مقدار سولفات کینیدین با فلوریمتری

آزمایش: محلول Stock از سولفات کینیدین به غلظت mg/ml 10 موجود است که با اسید سولفوریک N1/0 به حجم رسیده است، از آن غلظت های 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9 mg/ml تهیه کرده و برای هر غلظت درصد فلورسانس را توسط دستگاه بدست می آورید، حال اگر یک غلظت مجهول داشته باشید با بدست آوردن درصد فلورسانس آن، غلظت مجهول را حساب می کنیم. منحنی F ،C در غلظت کم خطی می شود. که آن را رسم کرده و غلظت مجهول را گزارش می دهیم. محور عمودی درصد فلورسانس است و محور افقی غلظت ها که برحسب mg/ml  نوشته میشوند.

 

طرز کار با دستگاه:

دستگاهی که کار می کنیم کامپیوتری است دو طول موج داریم، ابتدا E_x را در250nm  ثابت و به E_M در محدوده 250-700nm،range  میدهیم. و منحنی شدت فلورسانس برحسب l_EM را رسم می کنیم. در مرحله بعد برعکس عمل می کنیم. و بعد از پیداکردن E_M، آن را ثابت نگهداشته و به E_x رنج می دهیم، تا ثابت شود که Ex داده شده درست است. اگر Ex داده شده که 250nm است. درست نبود به Ex اولیه 50nm اضافه می کنیم و عمل را دوباره تکرار می کنیم. تا Ex موردنظر درست بدست آید. پس اول nm250 = _Ex l را ثابت داده و به _EMl دامنه می دهیم. از 250-700nm، منحنی برحسب E_M رسم می شود. که در محور عمودی درصد فلورسانس نوشته می شود.

 

مثلا _Ex l ، 450nm می شود. که حداکثر EM است. در مرحله بعد برای اثبات کار ثابت _EM l را گرفته یعنی nm 450 = _EM l و به _Ex l دامنه می دهیم nm (450-200)، اگر منحنی دوم ثابت کرد که _Ex l داده شد. اولیه که 250 nm بود درست است که هیچی و کار درست انجام شده است وگرنه _Ex l اولیه را اضافه کرده عمل را تکرار می کنیم. تا منحنی دوم ثابت شود. و منحنی دوم برای اثبات کار (یعنی درست دادن _Ex l اولیه است.

منحنی دوم برحسب _Ex l رسم می شود. محور افقی برحسب متغیر رسم می شود. چون در اثر برگشت الکترون به تراز یا مدار پائین تر مقداری اتلاف انرژی داریم. بنابراین طول موج _Ex l که مربوط به ناحیه UV است به طول موج بالاتر یعنی مرئی یاVis تبدیل می شود که همان نور فلورسانس است. بنابراین احتیاج نیست که به دامنه بیشتر از طول موج _EM l داده شود. در طول موج انتخابی محلول حلال یا بلانک نباید جذب داشته باشد. بنابراین در منحنی اول، حلال را امتحان کرده که در _EM l بدست آمده جذب نداشته باشد و اگر داشته باشد در این ناحیه نباشد و یا جزئی باشد والا باید قبل از کار، جذب آن را صفر کرد و از بین برد.

 

 

 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

اسپکتروفتومتری جذب اتمی Atomic Absorption

Atomic Absorption از ترکیب متدهای جذب و نشر حاصل شده است (emission-Absorption) و روش دقیق و حساسی است. اسپکتروفتومتر جذب اتمی مقدار نور جذب شده  به وسیله اتمهای تهییج  نشده موجود در شعله است که با غلظت نمونه متناسب است. انرژی الکترون آخرین مدار هر اتمی با انرژی الکترون مدار آخر اتمهای دیگر تفاوت دارد. پس با توجه به رابطه پلانک E=hγ  هر اتمی طول موج مخصوص دارد. که بر این اساس دستگاه AA ساخته می شود. هر چه تغییرات جذب در اتم های مختلف به هم نزدیکتر باشد دستگاه حساس تر می شود.

با توجه ترازهای مختلف انرژی برای اتمی (طول موجهای مختلف) اولین تراز موردنظر است که همان الکترون آخرین مدار است که به اولین تراز تحریک برود. احتمال انجام انتقال بین تراز پایه و اولین تراز تحریکی از هم بیشتر است. برای هر عنصر طول موجهای مختلفی است ولی یک طول موج حساس تر است. قسمت Atomizer همان شعله است. که اتمها بصورت آزاد در حال پایه می آیند. قانون بیرلامبرت فقط در محدوده خطی منحنی ها صدق می کند.

رابطه جذب و نشر بدین صورت بیان می شود که تمام مواد نور را در طول موجی جذب می کنند که منتشر می کنند. بنابراین نور قابل جذب برای اتمهای یک عنصر مثل cu بابستی وسیله ی اتمهای آزاد همان عنصر که به حالت تهییج شده هستند منتشر کردد.

نظیر فیلم فتومتر: نمونه بصورت ذرات ریز وارد شعله می شود. و با این تفاوت که یک لامپ بنام (هالوکاتد) قبل از شعله قرار گرفته است. جنس لامپ از شیشه است. کاتدهائی هستند که از چند عنصر تشکیل شده اند.کاتد لامپ از جنس عنصر موردنظر و آند تنگستن می باشد. گاز موجود در لامپ هلیوم- نئون یا آرگون است. فشار داخل لامپ 1-2 میلی متر جیوه و ولتاژ بکار رفته (1000-600 ولت) است. ابتدا گاز موجود در لامپ یونیزه شده و برخورد کاتیونهای گاز به کاتد باعث خارج شدن اتمهای آن عنصر می گردد. برخورد این اتمها به ذرات گاز، باعث تهییج  آنها شده و نور منتشر می کنند که این نور بطرف شعله فرستاده می شود شعله بایستی در جهت افقی عریض بوده و طول قسمت عمودی آن کم باشد درجه حرارت شعله مقدار بسیار کمی از اتمهای موجود در شعله (حدود یک درصد) بحالت تهییج در می آورد و 99 درصد اتمها بحالت تهییج نشده باقی می ماند. نور منتشر شده از لامپ به وسیله ی این 99 درصد جذب شده و باعث انتقال الکترونی در آنها می شود، پس مقدار نور جذب شده متناسب با غلظت اتمهای تهییج نشده موجود در شعله است که به درجه حرارت شعله بستگی ندارد. از A.A برای کنترل محصولات در صنعت از نظر عناصر موجود و اندازه گیری یک فلز در مجاورت فلزات دیگر و مقادیر کم مثل PPM یا trace استفاده می شود. و حدود 65 عنصر را با این روش می توان اندازه گرفت.

برای تجزیه کمی: ابتدا صفر دستگاه را با آب تنظیم می کنیم. و بعد منحنی را برحسب استانداردهای مختلف و درجات خوانده شده رسم می کنیم. سپس نمونه مجهول را در دستگاه قرار داده و می خوانیم قسمت های مختلف دستگاه در کاتد عنصر مورد نظر وجود دارد.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اتمیک

1- لامپ: - منبع نور H.C.L. است. از کاتد همان عنصر مورداندازه گیری است. گاز نئون بهتر از ارگون است. کاتد توخالی است تا تجمع اتم های تحریک شده در آنجا بیشتر شود و شدت نور ایجاد شده بیشتر باشد. هر چه شدت نور بیشتر باشد( البته نه با یک رابطه مستقیم) جذب بیشتر می شود. یعنی سیگنال الکتریکی بزرگتر است و راحت اندازه گیری می شود پس غلظتهای کمتری هم اندازه گیری می شود.

شدت نور هم با شدت جریان اعمال شده لامپ بیشتر می شود. ولی نه با افزایش بیشتر از حد ماکزییم چون عامل خود جذبی self absorption داریم. اتمهای Al تحریک نشده نور شستشو شده را جذب می کنند. هر چه شدت جریان کمتر است حساسیت بیشتر است یعنی تغییرات جذب نسبت C بیشتر است. افزایش شدت جریان بیشتر از حدمجاز باعث کاهش عمل لامپ می شود. عناصری که خواص فیزیکی مشابه داشته باشند و برای تحریک آنها انرژی نزدیک بهم لازم باشد. و lهای آنها هم روی هم نباشد برای تهیه لامپهای Multielement بکار می رود یکی از موثرترین لامپهای چندعنصری می باشد.سعی شده از یک منبع برای چند عنصر استفاده شود مثلا لامپ Xenon بعنوان منبع پیوسته بکار رفته است. (لامپ گزنون w 500) که در این صورت احتیاج به منوکروماتورهای دقیق داریم که lها را بخوبی تفکیک کند.لامپ دوتریم که مناسب 200-350nm است. طیف پیوسته می دهد که خطوط مختلف تفکیک نمی شوند.

2- Burner (استیلن- هوا):شعله خطی مناسب است .صحت و دقت جوابها به کار nubolizer بستگی دارد که قسمتی از burner  است . 85% محلول از دستگاه خارج می شود. nubolizer   باید قطعاتی با قطر یکسان و آئروسلهای یکسان ایجاد کند باید قطر ذرات کم و نزدیک بهم باشد. چون اتفاقی که در شعله برای قطعات می افتد بستگی به جرم آنها دارد.

اگر nubolizer 1% از محلول را با قطر یکسان به شعله برساند بهتر است با 20% از محلول را با قطرهای مختلف برساند. ml نمونه که در دقیقه به شعله می رسد uptake rate می گویند. تا حد زیادی uptake باعث زیاد شدن جذب می شود بیشتر از آن یا تاثیری ندارد و یا باعث سردشدن شعله می شود و سیگنال را کاهش می دهد.

جابجایی پلاسمید (دقت گلوله ای شیشه ای) نیز باعث کاهش جذب می شود. این یک فاصله اپتیم دارد. اگر حلال مخلوط آبی و آلی باشد uptake افزایش می یابد. ایجاد تعداد اتمهای بیشتر در شعله به عواملی بستگی دارد: 1- دمای شعله 2- نشر شعله

دما به نوع سوخت اکسیدانت بستگی دارد. نسبت سوخت و اکسیدانت 1 به 1 است .

هوا – هیدروژن کمترین مزاحمت را برای طول موجهای UV دارد چون T آن صفر است.

3- شکاف (Slit) :nm 0.2-0.5-1-2 که هرچه شکاف بیشتر باشد حساسیت کمتر است.

4- منوکروماتور: منشور‚ مانع طیف شعله می شود. برای مس 324.0 nm از نوع کوچک است

 

کار عملی اتمیک

محلولی از سولفات مس به غلظت PPM 500 از یون مس تهیه کنید. بعد غلظت های 0.3, 0.1, 0.9, 0.7, 0.5,  از یون مس تهیه کرده و سپس جذب انها را می خوانیم. و منحنی استانداردهای غلظت را برحسب جذب رسم می کنیم. و بعد با خواندن جذب مجهول غلظت مجهول را بدست می آوریم.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

گاز کروماتوگرافی  GC 

 GC برای شناسایی و تعیین مقدار انجام می شود. در GC با دو فاز سر و کار داریم: فاز ساکن و فاز متحرک، فاز متحرک یک گاز است و فاز ساکن می تواند مایع یا جامد باشد. فاز متحرک هیچ نقشی در جداسازی ندارد و یکی از تفاوت های GC با HPLC همین موضوع است. در HPLC فاز متحرک یک مایع است که در جداسازی نقش دارد. تنها نقش فاز متحرک در GC حمل مواد به جلو و خارج کردن آنها از ستون است. به همین دلیل کیفیت جداسازی در HPLC بهتر است از GC.

ابتدا نمونه را توسط سرنگ داخل injector تزریق می کنیم. نمونه پس از ورود به injector به بخار تبدیل شده و با فاز متحرک مخلوط شده، وارد ستون می شود. نمونه جذب ستون می شود و در زمانهای مختلف به وسیله گاز بی اثر از ستون بیرون می آید و وارد دتکتور می شود. ستون قلب دستگاه است زیرا عمل اصلی که جداسازی است در آنجا انجام می شود. دتکتور شناسایی را انجام می دهد جهت شناسایی مواد با GC از (R_t) Retention time  استفاده می شود. R_t زمانی است که طول می کشد تا جسم از دتکتور بیرون بیاید ،یعنی از زمان تزریق نمونه تا زمان ظاهرشدن پیک ها روی دستگاه که برای یک ماده تحت شرایط ثابت، مقداری ثابت است. بنابراین از مقایسه R_t معلوم با R_t مجهول، می توان اجزای موجود در مجهول را تشخیص داد.

 اگر مجهول و استاندارد، R_t یکسان داشتند، می توان نتیجه گرفت که هر دو نمونه یکی هستند.

پارامتر مهم دیگر در GC، سطح زیر منحنی (AUC) است. رکوردر به ما کروماتوگرامی می دهد که در راس هر پیک R_t  را می نویسد و AUC مربوط به آن را هم می دهد پس کروماتوگرام حاوی دو اطلاع ارزنده است:

1- R_t برای شناسایی کیفی جسم

2- AUC برای تعیین مقدار کمی جسم

گاز حامل: یک گاز بی اثر است (He, H₂, N₂)، He از همه بهتر است ولی چون گران است کاربرد کمی دارد. نگهداری H₂ هم خطرناک است چون قابلیت انفجار دارد، بنابراین N₂ استفاده می شود.

 

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه GC

1- سلیندر حاوی گاز حامل، در این دستگاه از گاز ازت که گازی خنثی، ارزان و در دسترس است استفاده می شود.

2- فلومتر، توسط این قسمت از دستگاه تنظیم فشار گاز حامل صورت می گیرد که اگر نمونه سریعتر بیرون بیاید ممکن است دو پیک روی هم بیفتند. هر چه فلو بیشتر باشد، مواد سریعتر از ستون خارج می شوند. . فلو برحسب ml/min است. (در کار با GC باید نوع گاز حامل و flue آن ذکر شود).در این دستگاه از گاز ازت با فلو ml/min 18 استفاده شد.در این دستگاه سه عدد فلومتر مربوط به تنظیم فلو گاز ازت، هوا و هیدروژن وجود داشت. که هر کدام را با میزان موردنیاز تنظیم کردیم

3- محل تزریق نمونه :(injector)دو محل تزریق در بالا و پائین وجود دارد که نمونه را به سرعت و توسط یک سرنگ در یکی از آنها بسته به اینکه از ستون بالایی یا پایینی استفاده می کنیم تزریق می کنیم. حجم نمونه تزریق شده در این آزمایش یک میکرولیتر بود. اما حجم سرنگ دستگاه ده میکرولیتر است. .با GC می توان نمونه های با حجم های بسیار کم تا دهم های میکرولیتر را اندازه گیری نمود. بعد از تزریق نمونه به سرعت و بدون مکث دکمه interface را فشار می دهیم. (حجم تزریق هم باید در کار با GC گزارش شود).

4- ستون (column):ستون نقش اصلی جداسازی را به عهده دارد که از جنس های مختلف می باشد:ستون فولادی،مسی ،شیشه ایی یا استیل باشد .که سخت پر می شود و حتما باید توسط کارخانه سازنده پر شود.

ستون مسی: انعطاف پذیری خوبی دارد و به راحتی پر می شود زیرا می توان آن را به صورت مستقیم پر کرد و سپس به صورت مارپیچ در آورد. ولی عیب آنها تشکیل اکسید مس در جداره ستون می باشد که می تواند برخی واکنش ها را کاتالیز کند. در حالی که ستون های فولادی این عیب را ندارند.

ستون های شیشه ای که مزیت آنها این است که داخل آنها را می توانیم مشاهده کنیم بنابراین اگر هوا گرفته باشد متوجه می شویم و عیب آنها شکننده بودنشان است. ستون های فولادی خیلی مستحکمند و باید در کارخانه بصورت مارپیچ در آیند، بنابراین پرکردن آنها مشکل است و احتیاج به دستگاه ویبراتور داریم. یک ویژگی مهم و تاثیر گذار در ستون ها پلاریته آنهاست که توسط کارخانه سازنده مشخص می شود که بر این اساس می توان ستون های مشابه را انتخاب کرد.

. ما در این آزمایشگاه از ستون Capillary استفاده می کنیم با طول حدود m 30، نوع ستون PE-1 است. N2 گاز ® فاز متحرک

GSC جامد      فاز ثابت

GLC مایع

برای فاز مایع از خاکه آجر یا chromosorb p که بی اثر است برای تثبیت مایع استفاده می کنند آن را پر می کنند. و مایع دیرجوش را روی خاکه آجر می دهند و تثبیت می کند که معمولا پارافین یا silicon greas است.

5- Oven:قسمت گرم کننده است.سه قسمت از دستگاه باید گرم شوند. Injector, oven و Column (که دو عدد هستند و در بالا و پایین oven قرار می گیرند) و نیز Detector قرار دارد

 دمای ستون باید چند درجه بالاتر از نقطه جوش دیر جوش ترین جزء موجود در نمونه باشد مثلا اگر بالاترین نقطه جوش °C 150 باشد، دمای ستون °C 170 باشد.دمای injector باید چند درجه بالاتر از ستون و دمای دتکتور هم چند درجه بالاتر از injector باشد با ستون با دو برنامه دمایی می توان کار کرد:اگر روش کار ایزوترمال باشد به oven یک دمای ثابت می دهیم اما اگر به روش برنامه ریزی کار کنیم، باید به آن برنامه دمایی بدهیم.

روش Isothermal ( با یک دمای ثابت کار می کنیم)، بیشتر زمانی استفاده می شود که در نمونه فقط یک ماده مورد شناسایی وجود دارد یا اگر چند ماده وجود دارد، نقطه جوش آنها نزدیک به هم است.

روش برنامه ریزی دمایی (programming): در مواقعی استفاده می شود که مواد موجود در نمونه Range وسیعی از نقطه جوش دارند و اگر ابتدا دمای Oven را بالاتر از نقطه جوش دیر جوش ترین ماده قرار دهیم، مواد با نقطه جوش کمتر تجزیه خواهد شد و نمی توان آنها را شناسایی کرد. بنابراین طوری دما را تنظیم می کنیم که با سرعت مشخصی از چند درجه بالاتر ازمواد به ترتیب نقطه جوش از ستون بیرون می آیند یعنی هر چه تعداد کربن های ماده بیشتر باشد دیرتر بیرون می آیند و پیک آنها دیرتر ظاهر می شود. وقتی نمونه ای حاوی چند جزء با طیف وسیع BP است نمی توان از روش ایزوترمال استفاده کرد زیرا با داشتن فقط یک دما، ممکن است یک جزء خیلی سریع بیرون بیاید و از دست برود یا بیرون آمدن آن، زمان طولانی ببرد. بنابراین باید از روش Programming استفاده کنیم، یعنی از چند Oven استفاده کرده و به هر یک، دمایی خاص می دهیم.در دستگاه ،3، Oven داریم که از تعداد موردنیاز بسته به کاربرد می توان استفاده کرد. هر Oven مثل یک ایستگاه می باشد که در هر یک، ماده زمانی متوقف می باشد و سپس با Rate خاصی از هر ایستگاه به ایستگاه دیگر می رود. پس در صورت استفاده از هر 3 Oven، 2 Rate می گیریم:درجه حرارت داده شده به Oven ها تجربی است و مثلا روی دمایی خاص گذاشته و بررسی می کنیم که پیک می گیریم یا نه ؟

اگر پیک در نمونه بهم چسبیده باشد، با کم کردن درجه حرارت Oven و فلوی گاز، پیک ها را جدا می کنیم.اگر فقط از 2 Oven استفاده می کردیم باید Time₃=0 ، Rate₂=0 می بود، در واقع به 3 Oven  برنامه نمی دهیم. Rate   بین 5-30 des/min می تواند باشد.

نقطه جوش زود جوش ترین ماده به چند درجه بالاتر از نقطه جوش دیر جوش ترین ماده برسد به این ترتیب می توانیم تمام مواد موجود در نمونه را شناسایی کنیم و کیفیت کار ما بالا می رود.

6-  :Detectorدتکتور بر اساس پاسخی که می دهد به دو دسته تقسیم می شود:

دتکتور انتگرالی، که پاسخ انتگرالی می دهد. که امروزه منسوخ شده است.

دتکتور تفکیکی، پاسخ این دتکتور به این صورت است که وقتی گاز حامل به تنهایی می آید، خط صاف و وقتی به همراه نمونه می آید یک پیک می دهد.

یکی از دتکتورهای تفکیکی که در GC استفاده می شود Flame Ionization Detector (FID) می باشد. نمونه ها بعد از اینکه از ستون خارج می شوند وارد دتکتور می شوند. نمونه ها در شعله دتکتور می سوزند و ایجاد یون و الکترون می کنند. آنچه مهم است الکترون هایی است که تولید می شوند. الکترونها جریانی را که از FID عبور می کند افزایش می دهند و غلظت نمونه متناسب با ­ میزان جریان است .

برای تشکیل شعله از سوخت هیدروژن با اکسیژن هوا استفاده می کنیم. چون نگهداری هیدروژن خطرناک است و امکان انفجار وجود دارد، یک هیدروژن ژنراتور وجود دارد که از تجزیه آب هیدروژن تولید می کند. برای تامین اکسیژن هم از کپسول هوا استفاده می شود.

نشانه روشن بودن دستگاه دتکتور این است که بخار آب از آن خارج شود. FID حساسیت بالایی دارد و عیب آن تخریب نمونه است در این دستگاه از FID استفاده کردیم. (نوع دتکتور هم باید در کار تحقیقاتی ذکر شود).

  7- رکوردر

چگونگی تنظیم دما:

دمای ستون را چند درجه بالاتر از نقطه جوش دیر جوشترین جزء موجود در نمونه قرار می دهیم و دمای injector را چند درجه بالاتر از ستون و نیز دمای دتکتور نیز چند درجه بالاتر از دمای injector قرار می دهیم.

برنامه دمایی ایزوترمال:

70°C = oven ستون

90°C = Injector

mLit = مقدار تزریق    100°C= Detector

علت استفاده از استاندارد داخلی:

در روش AUC باید از استاندارد داخلی استفاده کنیم که علت استفاده از استاندارد داخلی، حذف خطای حاصل از حجم تزریق می باشد. زیرا حجم تزریق کم است و احتمال اشتباه زیاد می باشد و برای استفاده کمی و حذف این خطا از یک استاندارد داخلی که از لحاظ ساختمان شیمیایی نزدیک به نمونه باشد استفاده می کنیم مثلا در این آزمایش برای تعیین مقدار اتانول از بوتانول به عنوان استاندارد داخلی استفاده می کنیم زیرا از لحاظ ساختمان شیمیایی نزدیک به نمونه اتانول است بنابراین ضمن اینکه پیک های مربوط به هر کدام جدا می باشد، خیلی هم از هم فاصله ندارند.

 

کار عملی جداسازی و شناسایی الکلهای (C₁-  C₅) کربنه

1- اطلاعات زیر را به دستگاه می دهیم:

Oven 1= 45°

Oven 2= 55°

Injector = 70°

Detector= 80°

Rate _{1, 2}= 6 des/min

Time 1= 1 min

Time 2= 1.5 min

 

2- اجزای دستگاه شامل 3،  oven ،2، injector (بالا و پایین) 2، ستون و یک، دتکتور می باشد. (در صورت استفاده از ستون بالا از injector بالا و بالعکس استفاده می کنیم) گاز حامل ازت می باشد.

سوخت دتکتور شامل H₂ (تامین با Hydrogen generator) و اکسید کننده O₂ (تامین با کپسول هوا) می باشد. اما تنها تفاوت کار در روش Programming آن است که در روش ایزوترمال، بلافاصله بعد از تزریق نمونه فقط دکمه inject را فشار می دادیم اما در این جلسه باید بلافاصله پس از تزریق، کاملا همزمان دکمه سفید روی دستگاه و دکمه interface را فشار دهیم زیرا با زدن دکمه سفید اجازه می دهیم که نمونه از oven 1 به oven 2 و از oven 2 به oven 3 برود، اگر این دکمه را فشار ندهیم نمونه در oven l خواهد ماند.

پس در این مرحله ابتدا محلول معلوم شامل متانول، اتانول، پروپرانولول، بوتانول و پنتانول را تزریق کرده، بلافاصله دکمه سفید و interface  را می زنیم و منتظر می شویم تا پیک ها روی کروماتوگرام ظاهر شوند. سپس صبر می کنیم تا دمای دستگاه (که تا 55° رسیده بود) پایین بیاید جهت سرد شدن سریعتر پس از اتمام کار دستگاه می توان در دستگاه را باز کرده تا دما به دمای oven 1 برسد. با رسیدن دما به ° 45 و شروع به کار oven 1، چراغ oven 1 روشن می شود. سپس مجددا محلول مجهول را تزریق کرده و مجددا دو دکمه فوق را فشار می دهیم تا پیک ظاهر شوند.

3- اعداد R_t ثبت شده روی کروماتوگرام مربوط به پیک های مجهول  را می خوانیم. هر کدام که با R_t ثبت شده روی پیک های مربوط به مجهول مطابقت بیشتر داشت نمونه حاوی همان جزء خواهد بود.

اگر شک کردیم که R_t مربوط به یک جزء اصلی در مجهول است یا ناخالصی، به غلظت ثبت شده در مقابل آن R_t (در جدول) مراجعه می کنیم اگر ناچیز و درحد صدم بود ناخالصی است و R_t و آن پیک را در نظر نمی گیریم.

پس از تزریق معلوم در بار اول، پیک های ناخالصی زیاد داشتیم، شرایط در هر بار تزریق کاملا ثابت است و فقط زمان لحظه ای زدن دکمه ها ممکن است تفاوت کرده و سبب ایجاد این پیک ها شده باشد پس مجددا انجام می دهیم

در صورتی که ندانیم جداسازی اجزای مجهول چقدر طول می کشد حتما باید حداقل نیم ساعت یگذاریم کروماتوگرام رسم شود و دستگاه را خاموش نکنیم.

ابتدا غلظت های 5، 7، 9 و 11 میلی گرم درصد تهیه کردیم. سپس 5 میلی لیتر از هر کدام را برداشته و با ml 1/0 بوتانول به عنوان استاندارد داخلی مخلوط کردیم.

روش مذکور، روش اندازه گیری الکل در الگزیز استامینوفن است که در این آزمایش برای راحتی کار از الکل به تنهایی استفاده کردیم.

در واقع این روش، روش کلی تعیین مقدار الکل و مواد فرار (بخصوص اسانسها) و نیز موادی که قابل تبدیل به مشتقات فرار باشند می باشد. (ترکیبات مشتق ساز ترکیبات حاوی سیلیس هستند که البته آلکالوئیدها را نمی توان با GC تعیین مقدار کرد).

نتیجه مشاهده شده از رکوردر:ابتدا اتانول (نمونه مورد اندازه گیری) و بعد بوتانول (به عنوان استاندارد داخلی) به صورت پیک نمایان شدند که چون غلظت اتانول بیشتر بود پیک آن هم خیلی بلندتر ظاهر شد و همچنین مطابق افزایش درصد اتانول، پیک ها هم بلندتر می شوند (پیک مربوط به اتانول)در صفحه رکوردر روی پیک ها Retention time مربوط به هر ماده یعنی زمانی که طول می کشد تا ماده از داخل ستون بیرون بیاید ثبت شده بود. در اطلاعات زیر پیک ها Area مربوط به R_t اتانول و بوتانول مشخص بود که نسبت آنها را محاسبه نمودیم.

 

بازگشت به فهرست

کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد HPLC                                               

می دانیم که کروماتوگرافی روشی است برای شناسائی و جدا سازی و اندازه گیری مواد است. HPLC یعنی کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد یا کروماتوگرافی مایع با کارکرد عالی است. HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. که فاز ثابت ممکن است جامد و یا مایع باشد و فاز متحرک مایع است.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC

1- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشو دهنده ستون ریخته شده است.

2- موتور یا پمپ: چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که حلال جریان داشته باشد باید فشاروجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ یا موتور استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود psi 4500 می تواند ایجاد کند. و باید بتواند فشار ثابت ایجاد کند. حلال توسط پمپ با فلوی ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر فلوئی که فاز متحرک می تواند داشته باشد ml/min 2.5 است. و بسته به نوع کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو فرق می کند، هر چه فلو کمتر باشد، فاصله ی پیک ها بیشتر است. چهارمخزن داریم مخزنD, C, B, A میزان فشار بستگی به فلوی ما دارد وقتی فلو ml/min 0.8 است میزان فشار حدود psi 1500 می شود. میزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداکثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداکثر تغییرات فشار Psi 100 است. حداکثر فلوریت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن می گیرد و با سرعت گذر ثابتی آن را بداخل دستگاه وارد می کند. در دمای آزمایشگاه کار می کنیم.

 به دو روش می توانیم کار کنیم:

1-  روش ایزوکراتیک isocratic: اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در یک مخزن بریزیم و از همان  مخزن فاز متحرک را برداشت کنیم از روش ایزوکراتیک استفاده کرده ایم. مثلا در کار عملی انجام شده درآزمایشگاه فاز متحرک( 80% بافر فسفات 12%  متانل و 8% استونیتریل) است که پس از صاف کردن همه را در یک مخزن مثل D می ریزیم و از همان مخزن پمپ برداشت  می کند.

2- روش گرادیانت gradient :اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف ریخته می شود. دستگاه قابلیت این را دارد که خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت کند (طبق داده های ما)، مثلا می خواهیم ازمخزن A، 80% از مخزن B 8% و از مخزن C 12% بکشد. و بعد نسبت ها را مخلوط می کند. از این روش وقتی استفاده می کنیم که نسبت های موردنظر را نمی دانیم و بخواهیم روش کارپیدا کنیم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانیم از روش ایزوکراتیک استفاده کنیم. فاز متحرک با فلوی ثابتی بر روی ستون حرکت داده می شود حداکثر فلو در این آزمایش ml/min0.8 یا 1 است. بعد از فعال کردن هر پمپ flow rate را از کم به زیاد کم کم بالا می بریم تا حدود ml/min  0.8 یا 1 و می گذاریم حدود یک ربع ساعت یا نیم ساعت با فلوریت بالا کار کند و بعد فلوریت را به تدریج پایین می آوریم تا صفر و بعد پمپ را عوض می کنیم. یا دستگاه را خاموش می کنیم، فلوریت که بالا برود فشار هم بالا می رود. بعد از اتمام کار ستون را با حلالهای شستشو دهنده می شوئیم.  حلالهای شستشو را در مخازن ریخته و پمپ ها را به ترتیب فعال می کنیم اول دستگاه را با آب و متانل شسته و سپس با متانل خالص می شوئیم. هر پمپ را که فعال کردیم باید ابتداهوا گیری کنیم.

تهیه بافرفسفات: 13.6 گرم از Po4H2K را وزن کرده (0.1M) و به حجم یک لیتر می رسانیم pH ، 4.5 می شود که با اسید فسفریک غلیظ حدود یک دو قطره pH را به حدود 3.5 می رسانیم.

3- injector: از سرنگهای مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می کنیم. حجم تزریق 30 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد کالوم یا پری کالوم می شود که محافظ ستون است، طول کاردکالوم حدو یک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پرکننده آن از جنس ماده پرکننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصی داشته باشد یا با ماده داخل ستون واکنش ایجاد کند درگاردکالوم انجام می شود و به ستون آسیبی نمی رسد.

4- ستون: طول ستونهای دستگاه حدود 30-10 سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترین ستون C₁₈ ، ODS آکتا دسیل سیلان است، ستونها را پس از اتمام کار باید با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده کردیم ستون را با آب و متانل و بعد با متانل خالص شستشو می دهیم. فاز ثابت بصورت ذرات ریزی در داخل ستون قرار گرفته است. که بر اثر چسبیدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه ابتدا وارد گاردکالوم و بعد وارد ستون می شود، گارد کالوم را پس از مدتی باید عوض کرد، ODS اکتا دسیل سیلان گروههای الکیل غیرقطبی زیادی دارد، فاز متحرکی که استفاده می کنیم قطبی است. فاز متحرک و ماده پرکننده ستون از نظر قطبیت باید عکس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معکوس هست. اگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غیرقطبی باشد سیستم را فاز نرمال و در صورتی که ستون غیرقطبی و حلال قطبی باشد. سیستم را فاز معکوس می گویند. مشتقات آلکیل سیلان و فنیل سیلان ایجاد ستونهای غیر قطبی می کنند و معمولا ستون غیر قطبی و فاز متحرک قطبی است بنابراین از فاز معکوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ یا Stainless steel است.

5- ردیابها: ردیابها باید حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسیعی برای غلظت باید خطی باشد. انواع رد یاب ها: (a )- مهمترین آنها ردیاب ماورا بنفش است که برای اجسامی که در ناحیه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در این دتکتور جذب انجام می شود و باعث کاسته شدن انرژی می شود که این کاسته شدن قابل اندازه گیری است. میزان کاسته شدن انرژی متناسب است با غلظت، باید طول موج را مشخص کنیم که در اینجاnm  l=225 است. حلال نباید در طول موج انتخابی جذب داشته باشد..

 .bردیاب ضریب شکست، این ردیاب خیلی حساس به حرارت است.از تغییرات یا تفاوتی که بین ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه نمونه ایجاد می شود استفاده می کنیم.

c. دتکتور فلورسانس حساس تر از UV است ولی کم مصرف می باشد چون موادی که خاصیت فلورسانس داشته باشند کم هستند.

 . dردیاب الکتروشیمیایی که عملکرد آن بر مبنای واکنش های اکسید و احیا می باشد.

6- ثبات (رکوردر): در اثر حرکات قلم پیک هائی رسم می شود که به  مجموعه آنها کروماتوگرام می گویند.به طریق کیفی پیک ها را براساس زمان باز داری یا نگهداری یا Retention time می شناسند. زمان بازداری فاصله زمانی از لحظه تزریق تا رسیدن به نقطه اوج یک پیک است. برای محاسبه کمی سطح هر نوار جذبی را حساب می کنیم، سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است که بوسیله انتگراتور یا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست می آید سطح هر نوار جذبی یعنی حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است. روش بریدن نوار و وزن کردن آنها روش قدیمی است. ولی امروزه توسط سطح سنج یا انتگراتور بدست می آید خود دستگاه AUC را مشخص می کند. می توان از ارتفاع هم استفاده کرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص کنیم AUC و ارتفاع با یک دستور ساده قابل تبدیل بهم هستند. روش رسم منحنی را انجام می دهیم. در محور افقی غلظت ها و در محور عمودی AUC . بعد از رسم منحنی استاندارد، غلظت مجهول را از روی رسم منحنی بدست می آوریم.

کار عملی تعیین غلظت نمونه آموکسی سیلین

محلول Stock آموکسی سیلین تهیه می کنیم mg 500  به حجم 500 cc  می رسانیم ،(ml/1cc1) مقادیرcc 2-6 از آموکسی سیلین برداشته، نمونه ها را به حجم 100 می رسانیم .از هر کدام 30 میکرولیتر به دستگاه تزریق می کنیم حدود 1.8 دقیقه آموکسی بیرون می آید.

منحنی استاندارد را طبق گفته رسم می کنیم و بعد غلظت محلول مجهول را مشخص می کنیم.

سوال :علت پیک منفی چیست؟

 

 

تفاوت HPLC با GC:

1- چون اغلب مواد آلی ناپایدار و کم فرار هستند. برای کار با GC باید آنها را به مشتقات فرار تبدیل کرد که ایجاد مشتقات فرار و باقی ماندن جزئی از مصرف مشتق ساز ایجاد پیک هائی می کند که نتایج آزمایش را مختل می سازد حال آنکه جداسازی این گونه مواد با HPLC به آسانی امکان پذیر است.

2- دو فاز ثابت و متحرک در HPLC بطور رقابتی عمل می کنند و جداسازی بوسیله دو فاز انجام می شود در صورتی که در GC یک فاز یعنی فاز ثابت عمل جداسازی را انجام می دهد.

3- یکی از مزایای HPLC وجود دتکتورهای آنست که برای هر دسته از ترکیبات دتکتورهای انتخابی ویژه وجود دارد که این تنوع دتکتورها از مزایای HPLC است. در صورتی که در GC دتکتور ها محدود تر می باشد.

5- مدت آنالیز در HPLC فوق العاده اندک است، آنالیز ترکیبات آلی ناپایدار و کم فرار مواد خوراکی، شیمیایی داروئی توسط HPLC امکان پذیر است.

6- مواد بسیار قطبی را با GC نمی توان آنالیز کرد در صورتی که با HPLC می شود.

7-  در HPLC به سبب دو فاز رقابتی پیک ها معمولا بصورت متقارن هستند در صورتی که در GC اغلب پیک ها بصورت نامتقارن هستند و محاسبه مساحت زیر منحنی یا AUC با اشکال و خطا است. ولی در HPLC بعلت وجود تقارن محاسبه AUC دقیق انجام می شود.

8- وجود آب در نمونه های آزمایش در HPLC اشکال ایجاد نمی کند در صورتی که در GC وجود اندک آب سبب تخریب دتکتور می شود.

9- وجود آب در شبکه کریستالی، وجود مولکولهای آب ئیدروژن در HPLC قابل تشخیص ولی در GC قابل ارزیابی نیست.

10- وجود ناخالص ها بخصوص ناخالصی های بسیار قطبی و یا با وزن مولکولی بالا در HPLC قابل تشخیص ولی در GC قابل تشخیص نیست.

 

 

 

مقایسه حوزه کارکرد، محدودیت ها و امتیازات سیستم GC و HPLC

 

بازگشت به فهرست

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

گاز کروماتوگرافی جرمی   GC-Mass

شناسایی دستگاه GC-Mass

مشابه دستگاه GC است. تنها تفاوت آن با GC معمولی این است که در این دستگاه دتکتور مربوطه دتکتور Mass است .تفاوتهای دیگر آن عبارتند از 1- از ستون موئینه (کاپیلری) استفاده می کنیم. نوع ستون به اسم تجارتی DB-5 است. از نظر پلاریته ستون دارای پلاریته متوسطی است. طولش m30است و برای کارهای عمومی استفاده می شود از آنجا که عوض کردن ستون زیاد ساده نمی باشد. سعی می کنیم ستونی را انتخاب کنیم که نمونه های زیادی را با آن تعیین کنیم.
2- احتیاج به حجم نمونه خیلی کمی برای تزریق داریم. معمولا 0.1 میکرولیتر حجم تزریق است، گاهی همین ml0.1 هم برای تزریق به این دستگاه زیاد است پس از سیستمی که برای رقیق کردن نمونه است و split یا spliless نام دارد استفاده می کنیم.Split یعنی چند شاخه شدن یعنی نمونه ای که به دستگاه تزریق می کنیم عدد split را به دستگاه می دهیم .مثلا100،نمونه به همان مقدار تقسیم شده و یکی از آن قسمتها وارد دستگاه می شود.

گاهی نمونه خالص، خیلی غلیظ است و حتی با طریق split خط پایه خوبی ندارد. پس این نمونه ها را رقیق می کنیم (معمولا با متانل) مجبوریم ml 0.2-0.1 از نمونه را تزریق کنیم، چون حجم حلال زیاد و حجم نمونه کم است که در اینجا به مقدار زیاد حلال به دستگاه می رسد که ممکن است فشار زیادی به دستگاه وارد کند، بنابراین به اندازه R_t حلال به دستگاه delay (تاخیر) می دهیم تا فیلاماندستگاه پس از خروج حلال روشن شود، که متانل بعد از 2 دقیقه می آید، یعنی دستگاه 2 دقیقه طیف جرم نمی گیرد.

در Mass احتیاج داریم که مقادیر میکروگرم از نمونه را تحت شرایط خلا بخار نموده و از آن طیف بگیریم . پس نیاز به خلا داریم که توسط توربوپمپ Turbo pump خلا mmHg ^7-10 ایجاد می شود. دو طریق عمده برای یونیزاسیون نمونه داریم: 1- طریقه Electron Ionization الکترون یونیزاسیون (EI): که انرژی حدود ^ev 70 به جسم اعمال می شود. مقدار شکست ها خیلی زیاد است، پس اطلاعات راجع به ساختمان شیمیائی جسم بیشتر می شود. تنها اشکال آن ندیدن پیک یون ملکولی در برخی اوقات است.

2- روش chemical Ionization یونیزاسیون شیمیایی (C.I): از گاز متان، ایزوبوتان، آمونیاک برای شکستن جسم استفاده می کنیم که طریق نرم تری است ولی یون ملکولی را می بینیم.ما به روش EI کار می کنیم.

در شروع کار با دستگاه بایدتشکیل خلا را چک کنیم که به میزان قابل قبولی رسیده باشد به خاطر اینکه وجود آب پیک (18)، ازت (28)، اکسیژن (32) را ایجاد می کنند.با این حال معمولا وقتی طیف Mass می گیریم به آن برنامه می دهیم که از mass 40 به بالا را بگیرد.

لازم است که ماهی یکبار کالیبراسیون را برای دستگاه انجام می دهیم، یعنی از یک جسم استاندارد طیف Mass بگیریم و ببنیم آیا مطابقت دارد یا نه؟ استاندارد: پرفلوروتری بوتیل آمین که در داخل خود دستگاه در داخل یک شیشه کوچک تعبیه شده این جسم دارای پیک های شارپی در نواحی به خصوصی هست، اگر دستگاه بتواند این پیک ها را پیدا کند، در آن صورت اعلام می دارد که آیا دستگاه کالیبره هست یا نه.

مزیت دیگر این دستگاه: امکان جستجو در کتابخانه (Library) دستگاه هست، بعد از گرفتن طیف می توان در کتابخانه دستگاه رفته و search یا جستجو نمود. برای هر گروه از مواد، کتابخانه جداگانه ای وجود دارد. دستگاه 10 کاندید را پیشنهاد می کند.

فاکتور P (purity) درصد احتمال صحت کاندیداها را نشان می دهد که اگر بالاتر از 80% (اعداد بالاتر از 800)  باشد، قابل قیول است.

اگر فاکتور P از 800 به بالا بود، به معنی این است که جسم با احتمال بیش از 80%  همان کاندید است. فرض کنیم پیک جسمی از 3 فراکشن C,B,A تشکیل شده باشد. این دستگاه ضمن اینکه کروماتوگرام را به ما می دهد، طیف Mass را نیز به ما می دهد. یعنی از هر جزء (Fragment) طیف Mass گرفته می شود.

تنها محدودیت این دستگاه این است که چون سیستم وارد کننده نمونه به دستگاه GC, Mass است. پس در واقع تنها موادی را می توان با GC شناسائی نمود که فرار باشند یا از آنها بتوان مواد فرار (توسط مواد مشتق ساز مواد فرار) تهیه کرد. مواد مشتق ساز عبارتند از: مشتقات سیلیس (تری میتل سیلان) که با جسم ایجاد مشتقات فرار قابل تزریق به GC را می نمایند.

قسمتهای مختلف دستگاه:

1- مخزن هلیم: He با خلوص بسیار بالا

2- injector: فلوی گاز حامل را روی Psi 12 تنطیم می کنیم. در قسمت split flow . میزان رقیق شدن نمونه را تعیین می کنیم، یعنی نمونه با گاز حامل تقسیم به نسبت می شود و تنها به نسبت 1به عدد تقسیم وارد ستون می گردد. ممکن است قسمت GC با یک دتکتور FID به عنوان یک بخش مستقل استفاده شود.

3- ستون: از نوع کاپیلری   طول: 30m                    نوع DB-5

بعد از مدتی ستون کثیف می شود که باید آن را مجددا احیاء (رژنره) کنیم، برای این کار مدتی ستون را در دمای ° 215-200 قرار می دهیم تا اشغالها بسوزد. پس از چند بار با این روش هم دیگر نمی توان ستون را احیاء مجدد نمود، و باید cm 20 اول ستون را قطع نمود، چرا که اغلب اشغالها در cm 20 اول ستون هستند.

4- detector( دتکتور همان دستگاه Mass می باشد.

5- Recorder

6- برای قسمت Mass احتیاج به پمپ برای ایجاد خلا داریم

برای کار با دستگاه : ابتدا وارد بخش Instrumental control می شویم که در اینجا میزان آب و هوا را مشاهده می کنیم. سپس calibration Mass انجام می شود که پیکهای استاندارد پیدا شده و منحنی استاندارد رسم می شود. اگر در هر بخش اشکالی ایجاد شود، در بخش Diagnostics اشکال را پیدا می کنیم.

سپس در بخش analysis موارد زیر تعیین می شود:

نام فایل مشخص می شود. 1- Data file

پارامترهایی مثل: دما، زمان و... مشخص می شود 2-GC Method

مشخصات فوق می تواند توسط فرد تعیین شود (با Edit) و یا پیش فرضهای دستگاه پذیرفته شود با فشار دادن کلید C، می توان کروماتوگرام ترکیب را بدست آورد و با کلید F₁ از هر محل دلخواه کروماتوگرام به طیف Mass را بدست آورد.

همچنین در بخش Chrome analysis می توان کروماتوگرام ماده را مشاهده کرد، بخشی از آن را بزرگ کرد و از هر قسمت دلخواه طیف Massرا بدست آورد.

پس از رسم طیف Mass با فشار دادن کلید L وارد کتابخانه (Library) دستگاه می شویم که
می توان در این بخش ترکیب را در کتابخانه موردنظر (مثلا  Libraryترپنوئیدها، و ...) جستجو Search نمود. همانطور که گفته شد فقط انتخابهایی که purity بالاتر از 800  قابل قبول می باشد. در نهایت خاموش کردن دستگاه را می توان بصورت دستی (manual) انجام داد یا از قسمت shut down استفاده نمود که انجام مراحل خاموش کردن دستگاه، چند ساعت طول
می کشد********

اساس کار با دستگاه

به ازای تعداد فراکسیونهای موجود در اساس در کروماتوگرام پیک ظاهر می شود. در کروماتوگرام محور Xها مشخص کننده R_t و محور yها تعیین کننده شدت پیک هاست، طوری که با اندازه گیری AUC می توانیم تعیین مقدار کنیم و نیز با R_t شناسایی کیفی انجام می دهیم.

تفاوت این دستگاه با GC اینست که در اینجا از هر فراکسیون در دستگاه Mass طیف جرم گرفته می شود. در این طیف های جرم پیک ها تک شاخه ایست. فراوانی Base peak ، 100% است و بلندترین پیک انتهایی پیک یون مولکولی می باشد. بعد از انتخاب پیک مربوط به هر فراکسیون در طیف کروماتوگرام تعیین (scan number)، دستگاه طیف جرم مربوط به آن را رسم کرده سپس طیف جرم را به کتابخانه دستگاه برده و برحسب درصد انطباق برای هر طیف 10 تا کاندیدا می دهد.

در این دستگاه GC و Mass از هم جدا نمی شود و طرز وارد کردن نمونه به دستگاه Mass  از طریق GC می باشد، بنابراین در این دستگاه، فقط از نمونه هایی می توانیم طیف جرم تهیه کنیم که بتوانیم به GC تزریق نمائیم. پس به طور عمده این دستگاه برای شناسایی و تعیین مقدار فراکسیونهای اسانس هاست که مواد فرار هستند.

ستون دستگاه GC از نوع لوله موئینه است زیرا باید حجم نمونه کم باشد تا طیف جرمی خوبی به دست آید. برای کاهش حجم نمونه چند کار انجام می شود: یک راه رقیق کردن اسانس با حلال (معمولا متانول) است و یا می توان به جای تزریق، فقط سرسوزن را به اسانس آغشته نمود. اما بازهم گاه مشاهده می شود که تنها با رقیق کردن، پیک ها از صفحه بیرون می زند. به همین منظور در دستگاه سیستم Split  طراحی شده که این سیستم آنچه را که از طریق injector وارد دستگاه می شود، تقسیم می کند و یک قسمت را وارد ستون کرده و بقیه را از پشت دستگاه خارج می کند که براساس میزان فلویی که ما برای دستگاه مشخص می کنیم این تقسیم صورت می گیرد که حداکثر آن معمولا 300/1 است.

برای شروع کار با دستگاه روش کار با دستگاه، باید مطمئن شویم که در دستگاه خلا برقرار شده زیرا باید طیف جرم را در خلا بگیریم. سپس باید دستگاه را کالیبره کنیم. به این منظور از ماده پرفلوئورو تری بوتیل آمین استفاده می کنیم.

دستگاه این ماده را با FC-43 می شناسد. این ترکیب دارای 6 پیک مشخص است و اگر این پیک ها سرجایشان بودند یعنی دستگاه درست کار می کند. این ماده را ما به دستگاه تزریق نمی کنیم، بلکه به دستگاه برنامه ای می دهیم تا براساس این ماده کالیبره شود، یعنی قبل از شروع هر کاری وقتی مطمئن شدیم خلا برقرار شده یک برنامه به دستگاه می دهیم تا از استاندارد استفاده کند.

در مرحله بعد باید متدهای GC و Mass را مشخص کنیم.

متدی که برای GC انتخاب می کنیم ESS است. این متد ترکیبی ازمتد ایزوترمال به مدت min 10 و بعد پروگرامیک  است که در آن دمای شروع و اتمام کار مشخص است. در متدی که برای Mass انتخاب می کنیم Mass range مشخص می شود که معمولا این محدود را از 40 تا 300 می گیریم. زیرا در محدوده کمتر از 40 پیک نداریم و نیز در این جا مزاحمت هایی هم وجود دارد. در متد Mass یک مدت زمان تاخیر (delay time) هم در نظر می گیریم، در این مدت فقط حلال (متانول) از دستگاه خارج می شود و طیف جرم آنرا نمی گیریم بنابراین در دو دقیقه اول پیکی رسم نمی شود. علت این کار اینست که تعداد مولکول های متانول نسبت به جرم ماده نمونه زیاد است که اگر طیف جرم آن را بگیریم فشار زیادی به دستگاه می آید.

در متد Mass روش گرفتن طیف جرم (Ionization mode) را هم مشخص می کنیم. به طور کلی دو روش وجود دارد EI(Electron Ionization) و CI(Chemical Ionization) که ما در این جا از روش EI استفاده می کنیم.شکسته شدن به روش EI شدیدتر از CI است و در این روش طیف های بیشتری مشاهده می شود زیرا شکست ها بیشتر است و ممکن است یون مولکولی مشاهده نشود.

ستون دستگاه با اسم تجارتی DB-5، دارای پلاریته متوسط بوده و در آن از گاز هلیوم به عنوان حامل استفاده می شود. (در اینجا از گاز ازت برای شکستن خلا استفاده می کنیم). اگر ببنیم کیفیت ستون کاهش یافته (به علت چسبیدن ماده به آن کارایی کم شده باشد) 10-20 سانتی متر اول ستون را قطع می کنیم. ستون از یک طرف به سیستم تزریق و از طرف دیگر به دتکتور وصل است. می توان تا 300 فلواسپلیت داشته باشیم. آنچه به ستون تزریق می شود با گاز حامل مخلوط شده و بعد تقسیم می شود.

در قسمت Instrumental control باید چک کنیم که در قسمت خلا آب و هوا نباشد بعد وارد قسمت آنالیز شده و متدهای مورد نظر را به دستگاه download می کنیم. سپس باید منتظر بمانیم تا دستگاه GC  گرم و آماده شود. وقتی چراغ GC روشن شد آماده تزریق خواهد بود. در اینجا مدت تزریق 70 دقیقه طول می کشد. هر چه طیف جرم را با غلظت کمتر بگیریم. طیف بهتری خواهیم داشت مثلا اگر فراکسیون A در بین دقیقه های 3تا5 بیرون آمده در هر ثاینه آن یک طیف جرم گرفته می شود و معمولا طیف جرم از راس پیک با ابتدا و انتهای پیک متفاوت است زیرا در قسمت راس غلظت فراکسیونها بیشتر است. غلظت بیشتر باعث شلوغ شدن طیف جرم می شود. بنابراین از طیف های جرم پای پیک یعنی با scan number پائین تر برای بردن به کتابخانه استفاده می کنیم.

در دستگاه کتابخانه های مختلفی برای جستجو وجود دارد که کتابخانه ترپن ها بهترین کتابخانه برای جستجوی اسانس هاست. (البته کتابخانه های بزرگ دیگری هم وجود دارد).گاه نتایج بسیار متنوعی با جستجو در کتابخانه های مختلف مشاهده می شود. معیار قبول کردن کاندیداها فاکتور purity می باشد که حداکثر آن 1000 است و نشاندهنده انطباق 100% می باشد. معیار قبولی کاندیدا purity برابر 800 را انطباق 80% است. و معمولا سه کاندیدای اول اهمیت بیشتری دارند یادداشت می شوند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست

اسپکتروفتومتری تشدید مغناطیسی هسته NMR

 وقتی پروتونی را در میدان مغناطیسی خارجی قرار می دهیم حاصل قرار گرفتن آن ایجاد چرخشی دیگر است. به فرکانس چرخش پروتون در میدان مغناطیسی فرکانس تقدمی پروتون ها می گویند و پروتونها به این ترتیب می توانند امواجی هم فرکانس با فرکانس چرخش را جذب کنند و جذب و نشر انرژی در پروتون ها اتفاق می افتد.

در ساخت دستگاه NMR به دو طریق می توان عمل کرد.

1- تغییر میدان مغناطیسی

2- تغییر فرکانس رادیویی

دستگاهی که در آن فرکانس ثابت است و میدان را به میزان مختصر تغییر می دهیم ساده تر است.

دستگاههای NMR  میدان آنها در محدوده کوچکی تغییر می کند و فرکانس ثابتی به همه پروتون ها می تابد.

بنابراین این نوع دستگاه یک میدان اولیه ثابت و یک میدان ثانویه متغیر دارد که sweep generator این کار را انجام می دهد. به این دستگاهها دستگاه continuous wave (c.w) میگویند.

دستگاههای جدید FT-NMR یا pulse-NMR

به این دستگاهها pulse NMR system گویند. هر پالس شامل تمام فرکانس هایی است که برای رزونانس رسیدن تمام پروتونها لازم است که در 0.01 ثانیه فراهم می شود.  میدان در آنها ثابت است و فرکانس تغییر می کند Magnet باید همواره روشن باشد تا یکنواختی میدان به هم نخورد در زمان کوتاه پالسی به نمونه فرستاده می شود که حاوی تمام فرکانس هایی است که برای به رزونانس رسیدن همه پروتون ها لازم است.

1- با این روش می توان تعداد زیادی طیف را در فواصل زمانی کوتاه گرفت

2- همچنین می توان از هسته هایی با فراوانی کم هم می توان طیف گرفت.(افزایش حساسیت)

3- از نمونه، با مقدار کم طیف بگیریم

طیف گیری از نمونه مقدار کم: زیرا با این دستگاهها می توان در زمان کوتاه تعداد Scanها را زیاد کرد که با جمع کردن پیک ها noise به اندازه پیک اصلی افزایش نمی یابد. افزایش شدت پیک ها با رادیکال تعداد اسکن متناسب است. اما از حدی بیشتر با افزایش تعداد اسکن هم طیف خوبی نمی گیریم و فقط باید مقدار نمونه را زیاد کنیم.

برای یکنواخت (ثابت) بودن میدان لازم است مگنت دائما روشن باشد. روشن بودن دائمی مگنت گرماایجاد می کند با استفاده از chiller آن را خنک می کنیم. مگنت دستگاه ما الکترومگنت فرکانس 80HTZ و میدان حدود 2Tesla است. البته از80HTZ  به بالا دیگر از الکترو مگنت استفاده نمی شودو به جای آن  از مواد ابر رسانا superconductive  برای ایجاد میدان استفاده می شود اما این مواد  در دمای زیر صفر این خاصیت را دارند که برای تامین این دما از ازت یا هلیم مایع استفاده می شود. (عیب آن)

هر چه میدان را قویتر کنیم R(resolution)بیشتر می شود.

 

دستگاه قدیمC.W-NMR

میدان در محدوده کوچکی تغییر می کند و فرکانس ثابتی به همه پروتون ها می تابد.

 محل جذب پروتون ها در NMR را محل شیفت شیمیایی پروتون ها می گویند. محل شیفت اطلاعات زیادی راجع به ساختمان جسم و محل قرار گرفتن پروتون ها به ما می دهد.

محل جذب:

محل شیفت شیمیایی را بر مبنای استانداردی به نام TMS تترامتیل سیلان بیان می کنیم جذب TMS در صفر PPM است مهمترین عامل موثر بر شیفت شیمیایی الکترونهای های اطراف پروتون است هر چه eها بیشتر روی پروتون ها اثر شیلدینگ بگذارند اثر میدان مغناطیسی کم شده و باید بر شدت میدان مغناطیسی افزوده شود.

TMS محافظت شده ترین پروتونها ها را دارد بنابراین به شدت از میدان مغناطیسی کم می کند و باید بر شدت میدان افزوده شود. بنابراین صفر بالاترین میدان مغناطیسی را دارد.

یک قطره TMS به همه نمونه ها اضافه می شود برای اینکه پیک صفر داشته باشیم- چون TMS 12 پروتون دارد که از لحاظ شیمیایی یکسان هستند با یک قطره جواب می دهد. در 27°C به جوش می آید و از نمونه ها به راحتی جدا می شود.تنها مشکل TMS اینست که با حلال های مائی قابل اختلاط نیست.

برای طیف از حلال مائی: TMS را در لوله مویین می ریزیم و آن را در لوله NMR می اندازیم  (استاندارد خارجی )ویا از DSS سدیم 2,2 دی متیل، سیلاپنتا سولفونات استفاده می کنیم . این ماده هم با یک قطره یک پیک شارپ می دهد.

استفاده از استاندارد خارجی دقت زیادی ندارد بعلت عدم یکنواختی اثرمیدان بر نمونه واستاندارد .

با دستگاه NMR قدیمی(CW-NMR) حدود 50mg نمونه و 0.5cc حلال لازم داریم در دستگاه جدید با 5mg هم می توان طیف گرفت.

وقتی از ماده ای مثل اتیل بروماید طیف می گیریم دو نوع پروتون داریم.

برای یافتن تعداد پروتون ها در هر محل احتیاج به انتگرال گیری داریم.

بنابراین قلم را طوری تنظیم می کنیم که جایی که پیک ندارد خط صاف رسم کند و ابتدای هر پیک متناسب با تعداد پروتون ها بالا رود.پروتون های تحت تاثیر اسپین پروتون ها کربن مجاور هم قرار می گیریند که باعث شاخه دار شدن پیک ها می شود.

تعداد شاخه ها= تعداد پروتون های کربن مجاور +1

وقتی پروتونی از دو طرف تحت تاثیر اسپین کربن مجاور قرار بگیرد فواصل شاخه ها J گفته

 می شود.اگر هر دو کربن مجاور یک پروتون با یک J اثر بگذارند بعضی شاخه ها روی هم می افتند.بنابراین تعداد شاخه ها از فرمول (n_A+n_B+1) بدست می آید.مقدار J گاهی برای شناسایی ترکیب به کار می رود و در ترکیبات ترانس مقدار J بیشتر است و برای شناسایی شکل فضایی ترکیب به کار می رود.

 

قسمت های مختلف دستگاه NMR:

1- میدان اولیه ثابت Magnet

2-میدان ثانویه متغییر sweep generator

3- فرستنده امواج رادیویی

4- گیرنده امواج رادیویی

5- رکوردر

6- لوله محتوی نمونه

تهیه نمونه:

مهمترین حلال بدون پروتون در NMR ،ccl₄ است اگر ترکیب در آن حل شود ، بعدCDCL₃ کلروفرم دو تره و بعد CD₃OD متانول دوتره و D₂O و در نهایت DMSO دی متیل سولفوکساید استفاده می شود(هر چه تعداد D در حلال بیشتر شود گران تر می شود.)

حلال های دو تریوم صد در صد خالص نیستند و پیک حلال دیده می شود مثلا پیک پروتون کلرفروم مربوط به CDCL₃ در 7.22ppm ظاهر می شود معمولا حلال های 99.5% استفاده می شود البته 99.999% هم وجود دارد که خیلی گران است.

اگر جسم در هیچ کدام از حلال های گفته شده حل نشد در CF₃COOH حل می کنیم پروتون اسید پیک می دهد.

اگر در حدود ppm12-11 ببینیم احتمال می دهیم پیک اسید است برای مطمئن شدن بعد از طیف گرفتن یکی دو قطره آب دو دوتره اضافه می کنیم و دوباره پیک می گیریم اگر پیک شدتش خیلی کم شد پروتون اسید بوده که قابل تبادل بوده است.

برای کالیبراسیون دستگاه NMR از ترکیبی استفاده می شود که پیک های sharp داشته باشد، مثل اتیل بنزن که سه نوع پروتون و سه پیک دارد.

روش کار C.W-NMR:

برای کالیبراسیون دستگاه، نمونه اتیل بنزن را داخل لوله NMR ریخته و داخل Magnet می گذاریم و با 20 دور در ثانیه آن را می چرخانیم .

هر 60HZ=1 ppm

زمان sweep (اسکن)، 50 ثانیه است.

با استفاده ازsweep zero، TMS را روی صفر تنظیم می کنیم.

شدت پیک ها را با Spectrum amplitude تنظیم می کنیم.

هدف از استفاده اتیل بنزن تنظیم دستگاه و اطمینان از تعداد شاخه هایی است که دستگاه می دهد. 

بعد از گرفتن طیف، انتگرال گیری را انجام می دهیم و برای این کار دکمه INT را می زنیم.

سپس دکمه reset را می زنیم برای اینکه مطمئن شویم که قلم ثبات به بالای کاغذ بر خورد

 نمی کند ابتدا قلم را بالا آورده و انتگرال می گیریم و بعد از اطمینان از مناسب بودن شدت انتگرال انتخاب شده ، قلم را پایین می آوریم و انتگرال می گیریم.

برای در آوردن نمونه spin را قطع کرده و دکمه eject را می زنیم.

با پیچ vertical قلم را پایین می آوریم ،کنترل عمودی و پیک را رسم می کنیم اگر شدت زیاد بود شدت را کم می کنیم تنظیم شدت با spectrum amplitude است.

نمونه: بوتیریک اسید

برای مشاهده پیک اسید عرض صفحه را دو برابر می کنیم و برای اینکه روی پیک های قبلی نیفتاد قلم را بالا می آوریم و برای مشاهده پیک اسید off set  600HZ=5ppm می کنیم و مقدار offset را با محل جذب جمع می کنیم در اینجا 6ppm را off set کردیم.

وقتی پیک ها از هم فاصله کمی داشته باشند. انتگرال پیوسته می گیریم زیرا خط پایه مشخص نیست تا برای پیک بعدی روی آن reset  کنیم.

روش کار pulse-NMR

در شروع کار باید از یکنواخت بودن میدان مطمئن شویم که مشخص کننده میدان ثابت، سیگنال دوتریوم است. یعنی اصطلاحا" میدان را روی سیگنالی که از دوتریوم می آید lock می کنیم. (Lock D₂) تا وقتی Lock برقرار باشد میدان هموژن است و می توان طیف گرفت. تا وقتی چراغ روشن باشد و اگر به هر دلیلی lock از دست برود مانند رفتن برق و ... هموژن بودن از بین رفته و حتی روی پیک های گرفته شده نمی توان حساب کرد و باید مجددا طیف گرفت. برای تامین سیگنال دوتریوم در همه حلالها دوتریوم داریم و حتی اگر نمونه تترا کلرید کربن (بهترین حلال) حل شود باز هم مقداری کلروفرم دوتره برای برقراری lock به آن اضافه می کنیم .

طیف گیری از هسته های با فراوانی کمتر: ¹³C در این مورد مهم است زیرا با فراوانی1.1% دارای اسپین 2/1 است. استفاده از طیف ¹³C وقتی اهمیت دارد که مثلا آلکان داریم زیرا تمام آلکان ها در PNMR پیک مشابه در ناحیه ppm 101-0.9 می دهند. اما محل جذب آلکانها در ¹³CNMR در محدوده بیشتر 15-35ppm است بنابراین در طیف ¹³C هر کربنی یک پیک می دهد مگر دو کربن که شرایط کاملا یکسان داشته باشند، یعنی محدوده وسیع طیف ¹³C سبب می شود کربن ها با اختلاف جزئی نیز با فواصل مناسب ppm 6-5 از هم جدا شوند.

محدوده جذب در PNMR ، 0-15ppm ولی در ¹³CNMR ، O-200ppm است که سبب ایجاد پیک های مستقل می شود.

مثلا در طیف PNMR اتیل بنزن 3 پیک زیر را دیدیم.

1-   شاخه ppm 1

2-   4 شاخه 2ppm

3-   پیک آروماتیک 7ppm

ولی در طیف ¹³CNMR اتیل بنزن 6 پیک می بینیم.

در طیف ¹³C ، splitting شاخه شاخه شدن نداریم. زیرا اثر پروتونها بر C را خودمان با عمل decoupling از بین می بریم تا طیف ساده تر شود و در مورد اثر ¹³C بر ¹³C هم احتمال کنار هم قرار گرفتن و مزدوج شدن دو ¹³C حدود صفر است پس در طیف ¹³CNMR پیک ها یک شاخه است و سطح زیر پیک نداریم.

بعلاوه ارتفاع پیک ها که نشان دهنده تعداد ¹³C در یک موقعیت خاص می باشد، هیچ اطلاعی در مورد ساختمان جسم نمی دهد، چون وجود ¹³C در مولکول، اتفاقی است و حتی ممکن است وقتی طیف کربن های همسان روی هم افتاده پیک کوچکتری ببنیم.

بنابراین در ¹³CNMR تنها محل شیفت شیمیایی است که اطلاعاتی در مورد ساختمان جسم می دهد.

کار با دستگاه pulse-NMR :

 گرفتن طیف هیدروژن اتیل بنزن و طیف کربن اتیل بنزن: در دستگاه یک مخزن آب برای خنک کردن مگنت وجود دارد. نمونه می چرخد تا تحت تاثیر یکنواخت میدان قرار گیرد.

همانند دستگاه قبل ارتفاع نمونه ها را تنظیم کرده و در مگنت قرار می دهیم. سپس Spin را روشن می کنیم. نمونه شروع به چرخش می کند. سیگنال دوتریوم را پیدا کرده و در وسط صفحه تنظیم می کنیم سپس دکمه lock را می زنیم تا lock D₂ برقرار شود و چراغ روشن شود و میدان یکنواخت گردد. برای کالیبره کردن دستگاه NMR از اتیل بنزن طیف می گیریم دستگاه وقتی تنظیم است که با یک scan طیف خوبی از اتیل بنزن بگیریم. برای طیف کربن وقتی تنظیم است که با یک Scan طیف خوبی را اتیل بنزن 80% بگیریم پس از گرفتن طیف انتگرال می کنیم..

طیف گیری از اتیل بنزن در PNMR :

طیف آن بصورت پیک CH₃ بین 2-1 و به صورت triplet ظاهر شد پس دو پروتون همسایه دارد. پیک CH₃ بین 3-2 و به صورت quartet ظاهر شد پس 3 پروتون همسایه دارد.

پیک آروماتیک به شکل singlet ظاهر می شود.

طیف گیری از اتیل بنزن در CNMR  :

کالیبراسیون برای CNMR اتیل بنزن هم نسبت به پیک کربنهای حلال صورت می گیرد، حلال بنزن است و طیف آن در 127ppm حاصل می شود.( بنزن دوتره) یعنی ابتدا حلال بنزن را به دستگاه می دهیم. پیک CH₂ چون به حلقه متصل است (الکترون کشنده) در میدان پایین تری نسبت به CH₃ ظاهر می شود.پیک های آروماتیک بین حدود 120 تا ppm150 ظاهر می شود.

برای مشخص کردن نوع کربن ها از تکنیک DEPT استفاده می کنیم. در این تکنیک زاویه پالس را تغییر می دهیم از مزایای 135, 90, 45 زیرا در هر زاویه پیک یکی از انواع c تغییر می کند به شکل زیر:

Dept 45° فقط C حذف می شود.

Dept 90° فقط CH مشاهده می شود.

Dept 135° فقط CH₂ معکوس می شود.

CH₃ هیچ تغییری در هیچ از یک زوایا نمی کند

 

 

 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست         

 

 

اسپکتروسکوپی مادون قرمزInfra red(IR)

مشاهده پیک در IR در اثر تغییر در سطوح انرژی ارتعاشی مولکول می باشد که بطور عمده شامل ارتعا شات کششی  stretching و خمشی bending  می باشد.محدوده جذب معمولی  IR  (2.5 تا 25 میکرومتر ) و یا برحسب عدد موج 400 تا4000  cm ^-1  می باشد.موقعیت پیکها در  IR  بستگی به ماهیت پیوند ها دارد. پیکهای واقع در انتهای طیف ، دارای انرژی بالاتر (طول موج کوتاهتر ) می باشند و اغلب مربوط به ارتعاشات کششی پیوند های کوتاه و قوی می باشند.استفاده از عدد موج در مقایسه با طول موج، جهت بیان محلهای جذب از این نظر که عدد موج با انرژی نسبت مستقیم دارد و همچنین جهت بیان محلهای جذب که از اعداد اعشاری استفاده نمی شود، ارجحیت دارد.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروسکوپ

1-   منبع نور: معمولا لامپ نرنست  (Nernst ) است که شامل میله ای است که مخلوط اکسید زیرکونیوم  Zirconium  ، ایتریوم Yttrium  و اربیوم  Erbium  می باشد و به کمک برق تا^oC 1500   ۫گرم می شود .

2-     محل نمونه: چون شیشه و کوارتز تقریبا همه طول موجهای ناحیه مادون قرمز را جذب می کنند ، از این رو نمی توانند به عنوان سل و یا به عنوان منشور دستگاه  IR  بکار روند. نمک های هالوژنه به این منظور بکار میروند و معمولا از کلرور سدیم به عنوان سل نمونه استفاده می شود ، که چون در آب حل می گردد ، اگر نمونه حاوی آب باشد ، از سل  AgCl و یا برخی از پلیمرها استفاده می گردد.

3-   منو کروماتور: که طبق توضیحات داده شده باید از جنس نمکهای هالوژنه باشد.

4-    دتکتور: از نوع حرارتی و ترموکوپل است . میزان انرژی نورانی جذب شده متناسب با میزان حرارت ایجاد شده می باشد .

5-   رکوردر (ثبات ): طیف نمونه را رسم می کند.

 

کاربرد طیف  IR :

1- از دستگاه  IR  بیشتر جهت شناسایی گروههای مختلف موجود در مواد استفاده می شود . ناحیه خاصی از  IR  که به نام ناحیه اثر انگشت یا  Fingerprint  نامیده می شود (ناحیه 910 – 1430   cm^-1)وجود دارد که طیف  IR  هر جسم مختص همان جسم بوده و برای اثبات یکسان بودن دو جسم از این ناحیه استفاده می شود .از روی طیف  IR  یک جسم مجهول میتوان گروههای مختلف موجود در آن را به دست آورد.

2- کاربرد از لحاظ کمی :مقدار مشخصی از نمونه در حلال حل می کنیم و در طول موج خاص درصد ترانس میتانس %T را بدست می آوریم. با توجه به نمونه معلوم، غلظت مجهول را بدست می آوریم.در بین تعداد نوار های جذبی متعدد ، باید نوار هایی را جهت تعیین مقدار استفاده کرد که از قانون بیر لامبرت به خوبی پیروی کنند.

آماده سازی نمونه:

1-   نمونه جامد: معمولا حدود 5 تا 15 میلیگرم نمونه را با حدود 400 میلی گرم برمور پتاسیم خالص و خشک مخلوط کرده ، بصورت پودر نرم و یکنواخت در آورده و با فشار زیاد بصورت یک قرص نازک و شفاف در می آوریم .  K Br در طول موج 2.5 تا 25 میکرون جذب ندارد و امکان میدهد که از نمونه طیف کاملی به دست آوریم.

میتوان از نمونه جامد به صورت سوسپانسیون ذرات بسیار ریز طیف گرفت . در این صورت حدود 5 میلیگرم جسم را با یک قطره از  Nujol  ( یک هیدرو کربور اشباع شده پارافینی با وزن مولکولی بالا ) به صورت سوسپانسیون  یکنواخت تهیه می کنیم .

نوژول در نواحی 3030 – 2860   cm^-1( بخاطر ارتعاشات کششی پیوند  C-H  ) و همچنین در نواحی 1460 و 1374   cm^-1(ارتعاشات خمشی پیوند  C-H  ) جذب دارد .

وجود جذب در نوژول باعث می شود که اگر جسم در این نواحی جذب داشت ،تداخل ایجاد شود ، که در این صورت میتوان از هگزا کلرو بوتا دی ان استفاده کرد که فاقد پیوند  C-H  می باشد و در نتیجه میتوان جذب مربوط به  C-H  نمونه را مشاهده کرد.

2-   نمونه مایع : میتوان2 قطره از مایع را بین دو سل کلرور سدیم قرار داد .

اگر نمونه محلول حاوی حلال باشد ، چون همه حلالها در نواحی مختلف  IR  کم وبیش جذب دارند ، باید از حلال تنها به عنوان شاهد استفاده کرد .اگر نمونه با ویسکوزیته کم یا فرار باشد، از سلهای با ضخامت  mm 0.1 استفاده می شود .

3-   اگر نمونه به صورت گاز باشد از سلهایی که 10 سانتی متر طول دارد ،استفاده کرده و نمونه را به   فضای آن تزریق می کنیم .

کالیبراسیون:برای کالیبره کردن دستگاه از فیلمهای پلی اتیلن یا پلی استیرن استفاده می کنیم که در نواحی خاصی پیک شارپ دارند. بعنوان مثال اگر پیکی در 907 کالیبره است ودستگاه پیک رسم شده را در 905 داد.اختلاف را محاسبه کرده در مورد نمونه اعمال می کنیم.نکته قابل توجه این است که در هر محدوده پیکها را بطور جداگانه باید بررسی کرد.

روش کار:شناسایی نمونه مجهول جامد ومایع

ابتدا طبق توضیحات داده شده در مورد تهیه نمونه های جامد و مایع،از هر کدام یک نمونه تهیه ودر دستگاه قرارداده و پیک آن را  می گیریم. بعد از کالیبره کردن پیکها با نمونه پلی استیرن،پیکها را شناسایی می شوند. 

 

 

 

 

بازگشت به فهرست

نظرات ()

لینک

---