کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC)

کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا (HPLC)

تسوت، گیاه شناس روسی به عنوان کاشف پدیده کروماتوگرافی شناخته شده است. او دراواخر قرن نوزدهم برای جداسازی رنگدانه‌های برگ سبز از یک ستون پرشده با کلسیمکربنات استفاده نمود. پس از او، دانشمندان زیادی در توسعه تئوری و روش کروماتوگرافینقش داشته‌اند. از جمله مارتین و سینج که به علت توصیف کروماتوگرافی تقسیمی موفق بهاخذ جایزه نوبل در سال 1952 شدند. در همان سال مارتین به همراه جیمز روشکروماتوگرافی گاز- مایع را معرفی نمود. تلاش‌ها و کوشش‌های این دانشمندان باعثگردید تا امروزه این روش به عنوان یکی از مهمترین روش‌های کروماتوگرافی در تمامیشاخه‌های شیمی و علوم زیستی مطرح شود.
واژه کروماتوگرافی امروزه به دسته‌ای ازروش‌ها اطلاق می‌شود که در آنها جداسازی اجزاء موجود در یک نمونه مخلوط، بر اساستمایل نسبی هر جزء به فاز ساکن هنگام عبور فاز متحرک از روی و یا درون فاز ساکناست. گونه‌ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری حرکت ‌می‌کند وبالعکس گونه‌ای که به فاز ساکن تمایل بیشتری دارد، با سرعت کمتری در طول ستون حرکتمی‌کند.
به علت آن که مواد با درجات گوناگون به فازهای ساکن تمایل دارند،می‌توان از این خاصیت جهت جداسازی آنها از یکدیگر استفاده نمود. زمان مورد نیازبرای حرکت هر جزء در فاصله مشخص را می‌توان برای تجزیه‌های کیفی به کار برد. همچنینمقدار اندازه‌گیری شده برای هر جزء جدا شده نیز جهت تجزیه کمی سودمنداست.
کروماتوگرافی با توجه به طبیعت فازهای ساکن و متحرک به دسته‌های مختلفیتقسیم می‌شود. برخی از روش‌های متداول کروماتوگرافی در جدول 1 ذکر شده است.

جدول 1- روش‌های متداول کروماتوگرافی [1].

نوع

فاز متحرک

فاز ساکن

گاز- مایع

گاز

مایع جذب شده روی جامد

گاز- جامد

گاز

جامد

زوج یون

مایع

مایع

تبادل یون

مایع

رزین تبادل یون

مایع- مایع

مایع

مایع جذب شده روی جامد

مایع – جامد

مایع

جامد

لایه نازک

مایع

جامد

کاغذ

مایع

مایع روی کاغذ جامد

دفع بر اساس اندازه

مایع

ژل

کروماتوگرافی فوق بحران

مایع فوق بحرانی

گونه‌های آلی متصل به سطح جامد

 

کروماتوگرافی مایع یکی از انواع کروماتوگرافی است که فاز متحرک در آن مایع است. کروماتوگرافی گازی نیز روش دیگری است که در آن فاز متحرک گاز است. اگر فاز متحرکگاز و فاز ساکن مایع باشد، روش را کروماتوگرافی گاز- مایع می‌نامند. روش‌هایکروماتوگرافی گاز- جامد، مایع- مایع و مایع- جامد نیز وجود دارند.
کروماتوگرام ،نموداری از پاسخ آشکارساز بر حسب زمان، حجم فاز متحرک یا فاصله است. اطلاعات مفیدینظیر میزان پیچیدگی نمونه، تعداد اجزاء موجود در نمونه، مشخصات کیفی اجزای نمونه،درک کمی از درصد گونه‌ها موجود در نمونه و مشخصه‌های کارایی ستون، به سادگی ازکروماتوگرام قابل حصول هستند.
در HPLC اغلب از ستون‌های پر شده با ذرات ریز فازساکن استفاده می‌شود. به همین علت سطح بیشتری از فاز ساکن در ستون در معرض اجزاءنمونه قرار می‌گیرد و در نتیجه راندمان جداسازی در این روش بیشتر از سایر روش‌هایکروماتوگرافی است.
در سیستم HPLC با استفاده از یک سوزن مخصوص وارد پیش ستونمربوطه می‌شود. هم‌ زمان از یک حلال مخصوص جهت ترکیب شدن با نمونه استفاده می‌شود. سپس نمونه با حلال مورد نظر ترکیب شده و وارد ستون مربوطه می شود و بر اساس میزانقطبیت حلال و ترکیب از یکدیگر جدا می‌شوند. همچنین نمونه بر اساس زمان بازداری ازیکدیگر تفکیک می‌شوند. شکل زیر اجزای یک سیستم HPLC را نشان می‌دهد [1].

 

شکل 1- اجزا سیستم HPLC

 کاربردها:
1-
جداسازی، خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژهترکیبات داروئی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها مورداستفاده قرار می گیرد .
2-
در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین هاانجام می شود)، آنالیز و هضم پروتئین

۳-تعیین ساختار پلیمرها
4-
مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف

***********************************************************

پیش از دهه 1970 روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی درآزمایشگاههای دانشمندان وجود داشت.

      در طول دهه 1970 بیشتر جداسازی مواد شیمیایی توسط روشهای متعددی انجام میشده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازکبوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین موادمشابه و یکسان کافی نبود.

      در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمانجداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش کروماتوگرافی ستونیانجام شد.

  به هر حال شدت جریان مایع درون این ستون ثابت و پایدار نبود و مدتها این سوالمطرح بوده که بهتر نیست این شدت جریان یا فشار ثابت باشد ؟ ( از کتاب شیمی تجزیه ،جلد 62 ، شماره 19 ، یکم اکتبر 1990 ).

      توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه 1970 انجام شد وپیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنینردیابهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.

      در اواخر دهه 1970 ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوساین امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه 1980 ،بطور رایجتری از HPLC  برای جداسازی ترکیبات شیمیایی استفاده می شده است.

     تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار رامتفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC  ، کامپیوتر و اتوماسیونبه سایر روشها اضافه گردید.

      به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوستهباعث سرعت در کار HPLC  گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهایتخصصی شده برای  HPLC  بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm  3  تا   µm  200 دارد.

      طول ستونهای HPLC سریع ،  کمتر از ستونهای HPLC  معمولی و برابر mm  3  است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC  جاسازی می گردند.
 

هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، شیمیایی و بیوشیمیاییو همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط   50 درصد  استفاده کنندگان HPLC  را نشان میدهد. ( از کتاب شیمی تجزیه ، جلد 62 ، شماره 19 ، یکم

 

 اکتبر 1990 ).

 در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطیاستفاده می شود.

/ 2 نظر / 249 بازدید
Mazyar Y

Hi Sina, Thank you for your weblog. It is nice to see young researchers are doing well in Iran Best regards, Mazy.

فرهاد

ممنون واقعا! من ارشد شیمی ام . ارائه داشتم،واقعا کمکم کرد!